喻亞麗，周運(yùn)濤，何 力，呂 磊，龐 昆

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，湖北武漢430223；3.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無(wú)錫214081）

膠原蛋白是動(dòng)物體內(nèi)含量最多、分布最廣的蛋白質(zhì)，是由三條肽鏈螺旋形成的纖維狀蛋白，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分[1]。目前已知的超過(guò)28種膠原蛋白，多富含于動(dòng)物的皮膚、骨骼、軟骨、肌腱、韌帶、血管、角膜中[2]，而動(dòng)物皮膚是膠原蛋白的主要原料來(lái)源。I型膠原蛋白由于其特殊的三螺旋結(jié)構(gòu)，具有低抗原性、很好的生物相容性和生物降解性。因此，膠原蛋白在化妝品、生物制藥、組織材料、生物醫(yī)學(xué)材料中有著廣泛應(yīng)用[3]。膠原蛋白普遍存在于動(dòng)物體內(nèi)，在選用膠原原料來(lái)源時(shí)，要綜合考慮其效能性及安全性。同哺乳動(dòng)物來(lái)源的膠原蛋白相比，水生生物沒(méi)有疾病傳播和飲食的限制，所以人們對(duì)其來(lái)源的膠原蛋白產(chǎn)生了很大的興趣[4]。有研究表明，硬骨魚(yú)魚(yú)皮原料具有一定的特殊性，如皮料的韌性和交聯(lián)程度較低，所以魚(yú)皮膠原蛋白遠(yuǎn)比豬皮、牛皮的膠原蛋白易于提取[5]。選用魚(yú)類(lèi)加工中產(chǎn)生的下腳料作為膠原蛋白提取原料，不僅能降低成本、得到更大的附加值，還具備很高的安全性。斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus），又名溝鯰、鉗魚(yú)，原產(chǎn)自北美，后在我國(guó)廣泛的引種養(yǎng)殖。在我國(guó)水產(chǎn)品養(yǎng)殖中占有重要的份量，2010年養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到21萬(wàn)t。作為水產(chǎn)品貿(mào)易中主要的出口品種，斑點(diǎn)叉尾鮰一般加工成魚(yú)片出口國(guó)外，在此過(guò)程中產(chǎn)生大量的下腳料。近幾年魚(yú)皮的價(jià)值被重視，充分利用魚(yú)皮資源、開(kāi)發(fā)魚(yú)皮制品，已經(jīng)成為淡水魚(yú)下腳料綜合利用的重要方面。本研究提取得到了斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)皮中的酸溶性膠原蛋白（ASC）和酶溶性膠原蛋白（PSC），同時(shí)進(jìn)行理化性質(zhì)的分析和比較研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)膠原蛋白的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

斑點(diǎn)叉尾鮰 武漢華南水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)；標(biāo)準(zhǔn)I型膠原蛋白、胃蛋白酶（活性3000U/mg） 博美公司；L-羥脯氨酸 索萊寶公司；蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)準(zhǔn)（高） TaKaRa公司；乙酸、HCl、NaCl、AgNO3等試劑 均為分析純；實(shí)驗(yàn)所用水 均為超純水。

恒溫磁力加熱攪拌器 江蘇金壇市億通電子有限公司；UV-2802PC型紫外分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；Spetrum 100型傅里葉紅外光譜儀 珀金埃爾默儀器有限公司；CR-21型高速冷凍離心機(jī) HITACHI公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠(chǎng)；Alpha 1-4 LST型冷凍干燥機(jī) 德國(guó)CHRIST公司；DSC 821e型差式掃描量熱儀 瑞士梅特勒公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 魚(yú)皮膠原蛋白的提取

1.2.1.1 魚(yú)皮前處理 用自來(lái)水沖洗斑點(diǎn)叉尾鮰，在冰上剝下魚(yú)皮，剔除皮下結(jié)締組織和脂肪組織。將魚(yú)皮用蒸餾水沖洗干凈，剪成0.5cm×0.5cm大小塊狀，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

取一定量魚(yú)皮，先用蒸餾水沖洗三次，除去魚(yú)皮上殘留的雜質(zhì)。4℃下，以料液比1∶10（W/V）加入0.1mol/L的NaOH攪拌5h，除去魚(yú)皮中非膠原蛋白和色素，然后冰水沖洗魚(yú)皮至中性。加入10%正丁醇（W/V=1∶30），靜置24h，以去除脂肪，冰水沖洗魚(yú)皮至中性。

1.2.1.2 酸溶性膠原蛋白（ASC）提取 參考文獻(xiàn)[6]的方法，并進(jìn)行改進(jìn)。取經(jīng)過(guò)前處理的魚(yú)皮，加入0.5mol/L的乙酸（W/V=1∶40），4℃低速攪拌24h。24h后，在5000r/min離心10min，取上清液，將未提取徹底的魚(yú)皮再次用等量的0.5mol/L乙酸提取。用乙酸提取三次后，混合上清液，加入一定量氯化鈉攪拌，至最終鹽濃度為0.9mol/L。靜置過(guò)夜，5000r/min離心10min后棄上清液。再將沉淀溶于0.5mol/L乙酸，8000r/min離心20min除去不溶性雜質(zhì)。經(jīng)三次鹽析后，將沉淀溶解于0.1%乙酸溶液中，用三蒸水進(jìn)行透析，直至用10g/L AgNO3檢測(cè)不到Cl-為止，然后對(duì)透析過(guò)的膠原蛋白溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到酸溶性膠原蛋白。

1.2.1.3 酶溶性膠原蛋白（PSC）提取 將1.2.1.1前處理過(guò)的魚(yú)皮，加入0.5mol/L的乙酸（W/V=1∶40）和0.1%（M/V）胃蛋白酶，4℃低速攪拌24h。5000r/min離心10min，取上清液。依次進(jìn)行鹽析、透析、冷凍干燥得到酶溶性膠原蛋白。

1.2.2 膠原蛋白純度的測(cè)定 參考文獻(xiàn)[7]的方法，并進(jìn)行改進(jìn)。稱(chēng)取一定量的膠原蛋白，加入6mol/L HCl（W/V=1∶100），于110℃水解24h。取1mL水解液，采用對(duì)二甲基氨基比色法[8]測(cè)定樣品液中羥脯氨酸含量，將羥脯氨酸含量乘以換算系數(shù)，即得到實(shí)際提取得到的純膠原蛋白的含量。按下式計(jì)算膠原蛋白純度：

式中：C為羥脯氨酸質(zhì)量濃度（μg/mL）；m為樣品質(zhì)量（g）；F為11.1換算系數(shù)。

1.2.3 紫外吸收光譜分析 參考郭恒斌等[9]的方法，將一定量的斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)皮膠原蛋白溶于0.5mol/L的乙酸中，配制成0.05%的膠原乙酸溶液，以0.5mol/L的乙酸作為空白對(duì)照。室溫下，使用紫外分光光度計(jì)，在190～400nm近紫外光區(qū)進(jìn)行掃描。

1.2.4 傅里葉紅外光譜分析 在干燥的條件下，取凍干的膠原蛋白樣品1mg，經(jīng)KBr壓片，用Spetrum 100紅外光譜儀對(duì)樣品進(jìn)行紅外掃描。掃描范圍為4000～550cm-1，掃描次數(shù)為32次。

1.2.5 SDS-PAGE電泳測(cè)定 參考Laemmli[10]SDSPAGE電泳方法分析膠原蛋白樣品，分離膠濃度7.5%、濃縮膠濃度5%。將提取的凍干膠原蛋白，配制成2mg/mL的膠原蛋白溶液。以1∶1的比例，取7.5μL膠原蛋白溶液分別加入7.5μL含有10%（V∶V）β-巰基乙醇的2×樣品處理液（將SDS、甘油、溴酚藍(lán)溶于0.5mol/L Tris-HCl緩沖液中）和7.5μL未加β-巰基乙醇的2×樣品處理液配成1mg/mL的溶液，100℃煮沸5min。電泳上樣15μL，直流穩(wěn)壓，蛋白樣品在濃縮膠中時(shí)的電壓為100V，進(jìn)入分離膠后調(diào)至160V。電泳結(jié)束后，將凝膠放入0.2%考馬斯亮藍(lán)染液（水∶95%乙醇∶冰醋酸=5∶4∶1，V∶V∶V）進(jìn)行染色1h；然后在脫色液（醫(yī)用酒精∶冰醋酸∶水=9∶1∶10，V∶V∶V）中脫色24h，至背景清晰。

1.2.6 熱變性溫度的測(cè)定 使用差式掃描儀測(cè)定樣品的變性溫度。取一定量的冷凍干燥的膠原蛋白以1∶40的料液比，加入0.05mol/L醋酸，使之水化（膠原蛋白水化物變性溫度分析時(shí)，最多可以在4℃保存2d）。取5～10mg樣品放于坩堝中，平鋪，加蓋密封，以空坩堝作為對(duì)照，掃描溫度范圍為20～50℃，升溫速率為1℃/min，樣品室氮?dú)饬髁繛?0mL/min。DSC譜圖中峰值對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)即為膠原蛋白的熱變性溫度。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠原蛋白的純度測(cè)定

膠原蛋白提取過(guò)程中，酸性條件會(huì)破壞膠原分子間的鹽鍵和Schiff鍵，引起膠原纖維膨脹、溶解，后通過(guò)鹽析的方法能夠提取得到粗膠原蛋白。由于膠原蛋白分子內(nèi)和分子間有緊密的交聯(lián)，延長(zhǎng)酸提取的時(shí)間可以提高膠原蛋白的溶解量。Elzbieta Skierka[11]的研究中，使用乙酸、乳酸和鹽酸進(jìn)行魚(yú)皮膠原蛋白的提取，發(fā)現(xiàn)0.5mol/L乙酸的提取膠原蛋白量較高。本實(shí)驗(yàn)中，酸溶性膠原蛋白提取時(shí)，每次24h分3次乙酸對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)皮進(jìn)行提取，魚(yú)皮能夠全部溶解，得到較高產(chǎn)率的酸溶性膠原蛋白。酶溶性膠原蛋白提取時(shí)，由于胃蛋白酶催化水解膠原蛋白的端肽，降低了膠原蛋白分子內(nèi)部的交聯(lián)，在酸性條件下24h即可完全溶解得到具有完整三螺旋結(jié)構(gòu)的酶溶性膠原蛋白。提取過(guò)程中，魚(yú)皮上的色素也大量溶解于乙酸中，通過(guò)多次鹽析和提高轉(zhuǎn)速的方法，能夠?qū)⑸睾碗s質(zhì)去除，得到純度較高的膠原蛋白。

按1.2.2方法測(cè)定羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的吸光度，得其回歸方程為：A＝0.0679C＋0.0003，相關(guān)系數(shù)R2＝0.9996（A代表吸光值，C代表羥脯氨酸濃度）。按回歸方程計(jì)算得ASC和PSC羥脯氨酸質(zhì)量濃度為分別為1.677、1.684μg/mL，計(jì)算得ASC純度為93.11%，PSC純度為93.46%。提取得到的ASC和PSC純度均高于周愛(ài)梅等[12]提取的羅非魚(yú)皮Ⅰ型膠原蛋白純度的84.61%，而低于林琳[13]提取的鱈魚(yú)皮和魷魚(yú)皮膠原蛋白純度的98%。不同的研究中，提取得到的膠原蛋白的純度具有一定的差異性，這可能是由于提取方法中料液比、提取溫度、原料等因素的不同造成的。本實(shí)驗(yàn)中提取的膠原蛋白的純度較高，該結(jié)果在紫外吸收光譜分析和SDS-PAGE結(jié)果中得到驗(yàn)證。

圖1 羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of hydroxyproline

2.2 ASC、PSC紫外吸收光譜

圖2為標(biāo)準(zhǔn)I型膠原蛋白的紫外吸收光譜，吸收峰在234nm處；圖3為提取得到的ASC和PSC掃描獲得的紫外吸收光譜，紫外吸收波峰均在233nm處。斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)皮膠原蛋白的吸收峰位置和標(biāo)準(zhǔn)I型膠原蛋白相近，初步判斷符合I型膠原蛋白的特征[14]。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)I型膠原蛋白紫外吸收光譜Fig.2 UV spectrum of collagen type I

圖3 斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)皮ASC和PSC紫外吸收光譜圖Fig.3 UV spectrum of ASC and PSC from channel catfish skin

不同于一般的蛋白質(zhì)，膠原蛋白組成中由于只含有少量芳香族氨基酸，在280nm處基本無(wú)吸收，而膠原肽鏈所含的C=O、-COOH、CONH2都是生色基團(tuán)，可在220nm附近產(chǎn)生較強(qiáng)的紫外吸收[15]。提取得到的膠原蛋白在280nm處只有很弱的吸收，說(shuō)明芳香族氨基酸含量很低。同時(shí)，也表明通過(guò)該方法提取得到的膠原蛋白雜蛋白含量少，純度很高。段宙位等[7]研究的羅非魚(yú)尾膠原蛋白的紫外最大吸收峰為232.35nm，辛菲等[16]研究的鲅魚(yú)皮酸溶性膠原蛋白的最大吸收峰為227nm，均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。由于膠原蛋白來(lái)源不同，從而氨基酸種類(lèi)和含量的差異，使膠原肽鏈所含的生色基團(tuán)有所不同，從而導(dǎo)致不同來(lái)源的膠原蛋白紫外吸收波峰存在一定的不同。

2.3 ASC、PSC傅里葉紅外光譜

由圖4和表1可知，斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)皮酸溶性和酶溶性膠原蛋白的吸收波峰具有一定的相似性。ASC和PSC的酰胺A分別在3301cm-1和3313cm-1處，該條帶的出現(xiàn)與N-H伸縮振動(dòng)有關(guān)，也表明了氫鍵的存在。Doyle等[17]的研究表明，自由的N-H伸縮振動(dòng)一般在3400～3440cm-1處，當(dāng)肽鍵中的N-H基團(tuán)包含在氫鍵中時(shí)，其振動(dòng)的波數(shù)會(huì)下降。酰胺B出現(xiàn)于2927cm-1和2948cm-1，這是膠原蛋白常出現(xiàn)的波數(shù)，同Phanat Kittiphattanabawon[18]研究的結(jié)果一致。

圖4 ASC和PSC傅里葉紅外吸收光譜Fig.4 FTIR spectra of ASC and PSC from skin of channel catfish skin

表1 斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)皮ASC和PSC紅外光譜特征吸收峰的位置及說(shuō)明Table 1 Fourier transform infrared spectroscopy spectra peaklocations and assignment of ASC and PSC from channel catfish skin

ASC和PSC的酰胺I出現(xiàn)在1638cm-1和1642cm-1處，表示了C=O的伸縮振動(dòng)，該條帶和蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)有關(guān)。這兩種膠原蛋白的酰胺Ⅱ出現(xiàn)在1545cm-1和1543cm-1處，這是由N-H的彎曲振動(dòng)和C-N的伸縮振動(dòng)引起的。同時(shí)，ASC和PSC的酰胺Ⅲ均在1235cm-1處，該波數(shù)同1454cm-1的比值大約為1，表明了三級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)的存在[19]。ASC和PSC的紅外吸收結(jié)果部分有所不同，這可能是由胃蛋白酶剪切掉的非螺旋區(qū)域引起的。因此，F(xiàn)TIR說(shuō)明了斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)皮ASC和PSC具有特殊的三級(jí)螺旋結(jié)構(gòu)和相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)。斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)皮膠原蛋白的傅里葉紅外圖譜同易繼兵[6]從獅子魚(yú)皮中提取的膠原蛋白的紅外圖譜相似，但吸收波峰略有不同，這可能是由于原料的不同、提取的膠原蛋白中所含的色素雜質(zhì)等因素造成，也有可能是在魚(yú)皮膠原蛋白在提取過(guò)程中有少部分結(jié)構(gòu)發(fā)生變化所致。

2.4 電泳分析

圖5電泳圖中，ASC和PSC是由α1和α2組成，其中從光密度來(lái)看α1和α2的比率為2∶1，因此膠原蛋白的組成應(yīng)該為（α1）2α2。這種結(jié)構(gòu)符合已知報(bào)道的真骨魚(yú)膠原含有兩條[20-21]或者三條[22]不同的鏈，斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)皮膠原蛋白的電泳圖譜同Prabjeet Singh[3]研究的條紋鯰魚(yú)魚(yú)皮的膠原蛋白的電泳圖譜相似，可以確定其為I型膠原蛋白。

電泳圖5中β為兩條肽鏈的二聚體，γ為三條肽鏈螺旋在一起的三聚體。ASC的β、γ鏈亮度強(qiáng)于PSC，而α弱于PSC，表明ASC的分子內(nèi)和分子間的交聯(lián)高于PSC[23]。這證明了在低溫條件下，胃蛋白酶可以切掉膠原的端肽，從而使膠原分子在電泳的前處理階段更容易以肽鏈的形式出現(xiàn)，大部分解旋為α鏈。ASC和PSC的α鏈的電泳遷移率相近，表明胃蛋白酶的切割位點(diǎn)靠近原膠原蛋白的非螺旋末端。β、γ鏈含量較高，也可以充分說(shuō)明低溫下，乙酸法提取和乙酸-胃蛋白酶提取方法均可以較好的保持膠原蛋白的結(jié)構(gòu)完整性。比較ASC和PSC的電泳圖譜，兩種樣品的電泳圖一致，是否添加β-巰基乙醇對(duì)膠原蛋白的肽鏈無(wú)影響。說(shuō)明在ASC和PSC在三螺旋區(qū)缺乏二硫鍵，這與膠原蛋白氨基酸組成中缺乏半胱氨酸的結(jié)論是一致的。

圖5ASC和PSC SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE patterns of ASC and PSC fromchannel catfish skin

2.5 變性溫度測(cè)定

斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)皮膠原蛋白的變性溫度見(jiàn)圖6。其中ASC的變性溫度為34.2℃，PSC為33.9℃。斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)皮膠原蛋白的變性溫度高于虹色金線(xiàn)魚(yú)的33.35℃[2]，低于曹軍魚(yú)ASC的38.17℃和PSC的36.03℃[24]，接近于草魚(yú)皮ASC的33.8℃和PSC的34.5℃[25]。不同來(lái)源膠原蛋白的變性溫度是由其亞氨基酸、體溫和環(huán)境溫度共同決定的[26]。一般冷水性魚(yú)類(lèi)的膠原蛋白的羥脯氨酸的含量比暖水性魚(yú)類(lèi)高，同時(shí)熱變性溫度也較低[27]。本實(shí)驗(yàn)中斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)皮膠原蛋白的變性溫度也同該結(jié)論相一致。PSC的主要結(jié)構(gòu)是肽鏈的三螺旋結(jié)構(gòu)，而在ASC中除了包含三螺旋結(jié)構(gòu)還包含有部分非螺旋的肽鏈[28]。斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)皮膠原蛋白變性溫度測(cè)定中，PSC熱焓值（△H=0.8759J/g）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ASC（△H=0.1855J/g）。這可能是由于胃蛋白酶的處理切除了PSC末端的肽鏈，需要更多的能量來(lái)使PSC的結(jié)構(gòu)更加有序，所以熱焓值也高于ASC。

圖6ASC和PSC的DSC溫度曲線(xiàn)圖Fig.6 DSC thermogram of ASC and PSC fromchannel catfish skin

3 結(jié)論

本研究中，低溫條件下，使用乙酸溶液提取和胃蛋白酶提取的方法，從斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)皮中提取膠原蛋白并對(duì)其理化特性進(jìn)行分析。

傅里葉紅外測(cè)定表明，ASC和PSC均在1235cm-1處具有吸收峰，表明其具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)。研究表明膠原蛋白具有低免疫原性，而其免疫原性部分來(lái)自于端肽。由于胃蛋白酶催化水解了膠原的端肽非螺旋區(qū)，而對(duì)螺旋區(qū)無(wú)作用，這樣溶解的膠原仍具有完整的三螺旋結(jié)構(gòu)，更降低了膠原的抗原性，具有良好的生物相容性[1]。酶溶性膠原蛋白在生物醫(yī)用材料、制藥和功能食品等方面具有更好的應(yīng)用潛能。但是對(duì)應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域的膠原材料，則應(yīng)保留其端肽，目的是保存其交聯(lián)位點(diǎn)，賦予組織材料所需的完整結(jié)構(gòu)。因此，將ASC和PSC的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，膠原蛋白生物相容性方面的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

目前，在食品工業(yè)中水產(chǎn)膠原蛋白應(yīng)用較多的是魚(yú)皮膠原蛋白，利用魚(yú)皮膠原蛋白可以生產(chǎn)新型的膠原多肽、氨基酸口服液、膠原蛋白飲料等。由于斑點(diǎn)叉尾鮰生長(zhǎng)環(huán)境溫度和魚(yú)皮氨基酸組成的影響，使其變性溫度低于豬、牛等哺乳動(dòng)物膠原蛋白的變性溫度，導(dǎo)致其應(yīng)用受到一定的限制。Sionkowska[29]研究表明較短時(shí)間的紫外照射可以使膠原分子之間形成更多的交聯(lián)結(jié)構(gòu)，提高其熱變性溫度。任俊莉等[30]研究發(fā)現(xiàn)使用戊二醛對(duì)膠原蛋白進(jìn)行交聯(lián)處理，可使其熱穩(wěn)定性提高。因此，采用一定的物理化學(xué)方法對(duì)膠原蛋白進(jìn)行處理，可以提高其熱穩(wěn)定性，使其在食品包裝、食品添加劑等方面有更廣泛的應(yīng)用。

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