傅夢(mèng)月，胡 倩，唐元元，姜 葦，丁蓉蓉，唐 雪，2，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院食品營(yíng)養(yǎng)與功能因子研究中心，江蘇無(wú)錫214122；2.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122）

隨著人們生活方式的改變，居民膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生了巨大變化，營(yíng)養(yǎng)因素、環(huán)境因素以及其他易感的遺傳因素疊加，帶來(lái)了許多健康問(wèn)題。過(guò)多的能量攝入在提高機(jī)體代謝水平，同時(shí)也相應(yīng)增加代謝副產(chǎn)物—ROS生成[1]。長(zhǎng)期代謝紊亂可使ROS產(chǎn)生顯著增多，改變機(jī)體氧化還原狀態(tài)促發(fā)慢性氧化應(yīng)激，由能量代謝誘導(dǎo)的氧化還原狀態(tài)失衡是導(dǎo)致機(jī)體病變的主要原因之一[2]。胃腸消化道是營(yíng)養(yǎng)素消化和吸收的主要場(chǎng)所，腸道是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素之一[3]。腸道粘膜極易受到由于飲食導(dǎo)致的氧化物和內(nèi)源性ROS的攻擊[4]。添加抗氧化劑可清除腸道ROS并有效預(yù)防由代謝紊亂促發(fā)的氧化應(yīng)激，恢復(fù)腸道粘膜正常功能。因此，維護(hù)腸道氧化還原狀態(tài)平衡，將對(duì)防治慢性代謝性疾病發(fā)生以及其避免自由基損傷機(jī)制具有重要意義。植物甾醇是一種天然甾體，主要存在于植物中[5]。有關(guān)研究表明，植物甾醇在抗氧化、抗癌、抗炎以及調(diào)節(jié)動(dòng)物生長(zhǎng)，促進(jìn)健康等方面具有積極作用[6]。具抗氧化功能的植物甾醇的共同特征是它們分子側(cè)鏈上都有一個(gè)亞乙基[7]。劉慧瓊等[8]研究表明，β-甾醇具有清除羥自由基和抑制超氧陰離子的作用。植物甾醇具有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)功能，可以調(diào)節(jié)應(yīng)激條件下動(dòng)物的生長(zhǎng)[9]。植物甾醇還可作為免疫調(diào)節(jié)因子，刺激淋巴細(xì)胞和T細(xì)胞增殖[10]。可見(jiàn)，植物甾醇是一種純天然具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的抗氧化功能因子。而關(guān)于植物甾醇攝入機(jī)體后是否影響腸道的氧化還原狀態(tài)，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬設(shè)計(jì)不同水平植物甾醇日糧，研究植物甾醇對(duì)肉雞腸道氧化還原狀態(tài)的影響，進(jìn)一步闡明植物甾醇抗氧化功能，為其應(yīng)用與開(kāi)發(fā)提供新的理論依據(jù)與思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1日齡健康雄性羅斯肉雞（體重約44g） 江蘇無(wú)錫祖代雞場(chǎng)有限公司；植物甾醇 渭南瑞源生物科技有限責(zé)任公司。

5430R型離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；F96型熒光分光光度計(jì) 上海棱光技術(shù)有限公司；KJ-300型超聲波發(fā)生器 無(wú)錫市科潔超聲電子設(shè)備有限公司；DK-600型電熱恒溫水槽、722型光柵分光光度計(jì) 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Mk3型酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；WH-3型微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與飼養(yǎng) 1日齡雄性羅斯肉雞105只，隨機(jī)分為：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組（L1、L2、L3、H1、H2、H3）。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，實(shí)驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)日糧分別添加0.015‰、0.020‰、0.025‰的低羥基值植物甾醇組（L組）和0.025‰、0.050‰、0.075‰的高羥基值植物甾醇組（H組）。每組3個(gè)重復(fù)（籠），每個(gè)重復(fù)5只雞。

肉雞基礎(chǔ)日糧參照《家禽營(yíng)養(yǎng)需要》[11]，基礎(chǔ)日糧組成見(jiàn)表1。前期和中期飼料均制成顆粒。實(shí)驗(yàn)期46d，采用籠養(yǎng)，24h光照，自由采食與飲水。1～21日齡飼喂前期顆粒料，22～46日齡飼喂中期顆粒料。按常規(guī)方法進(jìn)行免疫接種。

1.2.2 樣品制備 在實(shí)驗(yàn)的第46d采集樣品（每個(gè)重復(fù)取2～3只，每組共取8只）。肉雞稱(chēng)重后斷頸取血處死。取十二指腸、空腸、回腸，用預(yù)冷生理鹽水按1∶10（W/V）制備組織勻漿液，測(cè)定氧化還原指標(biāo)。

1.2.3 氧化還原狀態(tài)的測(cè)定 組織的氧化還原指標(biāo)：還原型與氧化型谷胱甘肽的比值（GSH/GSSG）、總抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA），采用試劑盒測(cè)定，所有測(cè)定步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2003初步處理后，用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因子方差分析和鄧肯氏多重比較，分析各組間的差異顯著性。顯著水平為p＜0.05。數(shù)據(jù)用±SD表示。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（%）Table 1 Ingredient composition of the basal diets（%）

2 結(jié)果與分析

2.1 植物甾醇對(duì)肉雞十二指腸氧化還原狀態(tài)的影響

谷胱甘肽是體液中含量最豐富、維持生物大分子-SH和-S-S-氧化還原平衡的關(guān)鍵分子，已有研究表明，谷胱甘肽與體液的氧化還原平衡有著非常緊密的內(nèi)在聯(lián)系[12]，故可用GSH/GSSG比率借以評(píng)估脂質(zhì)過(guò)氧化損傷情況。機(jī)體防御體系的總抗氧化能力（T-AOC）的強(qiáng)弱與健康程度存在著密切聯(lián)系。脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性的丙二醛（MDA），因此MDA含量的高低可間接反映出細(xì)胞損傷的程度。因此，通過(guò)測(cè)定這幾個(gè)指標(biāo)可以間接反映出機(jī)體的抗氧化水平。

表2 植物甾醇對(duì)肉雞十二指腸氧化還原狀態(tài)的影響Table 2 Effect of phytosterols on redox state of duodenum of broiler chickens

植物甾醇對(duì)肉雞十二指腸GSH/GSSG、T-AOC、MDA的影響可見(jiàn)表2。由表2可知，在基礎(chǔ)日糧中添加植物甾醇可使肉雞十二指腸的GSH/GSSG比值顯著升高（p＜0.05），其中0.075‰ H3組、0.050‰ H2組、0.025‰ H1組GSH/GSSG比值相應(yīng)高于0.025‰ L3組、0.020‰ L2組、0.015‰L1組。與對(duì)照組相比肉雞十二指腸的T-AOC均降低，與0.015‰ L1組、0.025‰H1組相比，0.025‰ L3組、0.075‰ H3組的T-AOC顯著降低（p＜0.05）。與對(duì)照組相比，0.025‰ H1組、0.050‰ H2組的MDA降低，0.015‰ L1組的MDA升高，0.020‰ L2組、0.025‰ L3組、0.075‰ H3組的MDA無(wú)顯著差異。

2.2 植物甾醇對(duì)肉雞空腸氧化還原狀態(tài)的影響

植物甾醇對(duì)肉雞空腸GSH/GSSG、T-AOC、MDA的影響可見(jiàn)表3。由表3可知，在基礎(chǔ)日糧中添加植物甾醇可使肉雞空腸GSH/GSSG比值顯著升高（p＜0.05），其中0.075‰ H3組、0.050‰ H2組、0.025‰ H1組GSH/GSSG比值相應(yīng)高于0.025‰ L3組、0.020‰ L2組、0.015‰L1組。與對(duì)照組相比肉雞空腸T-AOC均降低，與0.015‰ L1組、0.025‰ H1組相比，0.025‰ L3組、0.075‰ H3組的T-AOC顯著降低（p＜0.05）。與對(duì)照組相比肉雞空腸MDA均降低，其中0.015‰L1組、0.025‰L3組、0.075‰ H3組的MDA顯著降低（p＜0.05）。

表3 植物甾醇對(duì)肉雞空腸氧化還原狀態(tài)的影響Table 3 Effect of phytosterols on redox state of jejunum of broiler chickens

2.3 植物甾醇對(duì)肉雞回腸氧化還原狀態(tài)的影響

植物甾醇對(duì)肉雞回腸GSH/GSSG、T-AOC、MDA的影響可見(jiàn)表4。由表4可知，在基礎(chǔ)日糧中添加植物甾醇可使肉雞回腸GSH/GSSG比值顯著升高（p＜0.05），其中0.075‰ H3組GSH/GSSG比值顯著高于0.025‰H1組，0.025‰ L3組GSH/GSSG比值顯著高于0.015‰L1組（p＜0.05）。與對(duì)照組相比，0.015 L1‰組、0.050‰H2組和0.075‰H3組肉雞回腸T-AOC均提高。與對(duì)照組相比，肉雞回腸MDA均升高，其中0.015‰L1組、0.025‰ L3組、0.075‰ H3組的MDA顯著升高（p＜0.05）。

表4 植物甾醇對(duì)肉雞回腸氧化還原狀態(tài)的影響Table 4 Effect of phytosterols on redox state of ileum of broiler chickens

3 討論與結(jié)論

腸道作為主要的免疫器官之一，亦是潛在的ROS損傷位點(diǎn)。正常情況下，機(jī)體中自由基的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但由于種種原因，導(dǎo)致機(jī)體自由基產(chǎn)生增多或機(jī)體清除自由基能力下降時(shí)，促發(fā)氧化應(yīng)激[13]。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，產(chǎn)生的自由基超出清除系統(tǒng)的能力所時(shí)，過(guò)量的自由基會(huì)給機(jī)體造成不可逆轉(zhuǎn)的氧化損傷[14]。李武等[15]研究表明，高脂日糧引發(fā)小鼠腸道氧化還原狀態(tài)失衡，硫辛酸通過(guò)直接清除自由基以及提高抗氧化通路相關(guān)功能基因表達(dá)水平解除氧化應(yīng)激，有助于防治高脂日糧引發(fā)的腸道功能損傷。因此，維持腸道氧化還原狀態(tài)的平衡對(duì)于維持腸道正常功能以及機(jī)體健康具有重要意義。

眾多研究表明，植物甾醇具有抗氧化能力[16-19]。植物甾醇具有清除羥自由基和抑制超氧陰離子的作用，并且能顯著提高荷瘤小鼠CAT活性，抑制由四氯化碳所致的小鼠和大鼠肝臟丙二醛（MDA）的生成[20]。這種抗氧化效果與其自身分子結(jié)構(gòu)（分子側(cè)鏈上的亞乙基）密切相關(guān)[7]。因此，植物甾醇維持腸道氧化還原穩(wěn)態(tài)可能與其分子結(jié)構(gòu)及抗氧化活性有關(guān)。此外，植物甾醇在腸道的吸收率要顯著低于膽固醇，并且能夠沉淀小腸中的膽固醇，使其呈現(xiàn)不溶解狀態(tài)，進(jìn)而不能被吸收[20]?？梢?jiàn)，植物甾醇對(duì)消化系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)可能通過(guò)影響腸道對(duì)養(yǎng)分的吸收利用速度，保證營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)能夠緩慢、平和地進(jìn)入體循環(huán)，有利于進(jìn)食后機(jī)體內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定。由此可知，腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是植物甾醇多方面共同作用的結(jié)果。

本實(shí)驗(yàn)以雄性羅斯肉雞作為研究對(duì)象，通過(guò)在基礎(chǔ)日糧中添加不同劑量植物甾醇，測(cè)定了反映機(jī)體抗氧化水平的幾個(gè)主要的生化指標(biāo)，研究其對(duì)腸道氧化還原狀態(tài)的影響。結(jié)果表明，基礎(chǔ)日糧中添加0.015‰、0.05‰和0.075‰植物甾醇可使肉雞回腸總抗氧化水平（T-AOC）提高。同時(shí)，GSH/GSSG比值亦顯著升高，且隨植物甾醇含量的增加而升高。大量人體和動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)植物甾醇能降低血液中膽固醇含量且不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生任何副作用[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，植物甾醇具有降低氧化產(chǎn)物MDA水平的作用。與對(duì)照組相比，肉雞空腸MDA均降低，而在回腸則無(wú)此明顯變化。推測(cè)，植物甾醇可能有選擇性的在腸道內(nèi)不同部位的發(fā)揮抗氧化效果。長(zhǎng)期攝入高脂飲食可導(dǎo)致機(jī)體抗氧化能力顯著降低，ROS和MDA顯著升高，形成慢性氧化應(yīng)激[15]。在基礎(chǔ)日糧中添加植物甾醇能降低脂質(zhì)過(guò)氧化物產(chǎn)物MDA的含量，說(shuō)明植物甾醇具有防止慢性氧化應(yīng)激的功能，且存在組織特異性[21]。

綜上，植物甾醇能具有提高腸道抗氧化能力，維持腸道氧化還原穩(wěn)態(tài)的功能，但其抗氧化作用的具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

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