張利燕，常 虹，趙麗芹，周家華

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)業(yè)綜合發(fā)展研究所，北京 100097；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

人體在新陳代謝過(guò)程中，隨著氧的消耗會(huì)生成許多自由基，這些自由基是許多生理和病理過(guò)程的積極參與者，對(duì)機(jī)體危害極大[1]，是導(dǎo)致人類癌癥和心臟病等慢性疾病發(fā)生的主要原因之一[2]。食品在貯藏過(guò)程中，在外界因素的作用下會(huì)發(fā)生腐敗變質(zhì)。為了清除體內(nèi)的自由基，降低人類患慢性疾病的可能，以及防止食品的腐敗變質(zhì)延長(zhǎng)食品的保質(zhì)期，經(jīng)常在食品中添加一些人工合成的抗氧化劑。近年發(fā)現(xiàn)，人工合成抗氧化劑均具有一定的毒性，黃酮類化合物具有高效、低毒、廉價(jià)、抗氧化性強(qiáng)的特點(diǎn)，除此之外許多研究已表明，黃酮類化合物還具有多種生物活性，如抗菌、消炎、抗突變、降壓、清熱解毒、鎮(zhèn)靜、利尿、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等[3-6]。隨著人們生活水平的提高，添加天然抗氧化劑起到藥食兩用的作用越來(lái)越受到消費(fèi)者的青睞。板栗花為殼斗科（Fagceae）栗屬植物栗（Castanea mollissima Blμme）的雄性花序，其花粉含豐富的活性鈣、磷、維生素E、雌二醇、黃酮、蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)[7]。其中，板栗花中的黃酮物質(zhì)是所有花粉中含量最高的，凝聚了天然、綠色、營(yíng)養(yǎng)、保健等特點(diǎn)[8-11]。然而，在板栗的種植中，雄花序遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于雌花序，為了保證板栗的品質(zhì)，多余的雄花序?qū)⒈皇璧鬧12]，從而造成資源的浪費(fèi)，同時(shí)產(chǎn)生大量農(nóng)業(yè)廢棄物。從環(huán)保和發(fā)展循環(huán)經(jīng)濟(jì)的觀點(diǎn)來(lái)看，對(duì)農(nóng)業(yè)和食品行業(yè)中植物廢棄物的再次開發(fā)利用是目前發(fā)展的新趨勢(shì)，若能對(duì)廢棄的板栗雄花序進(jìn)行天然抗氧化物質(zhì)的開發(fā)，將在生產(chǎn)實(shí)踐上發(fā)揮重要作用。目前植物中黃酮類物質(zhì)的提取多采用醇浸提、微波、超聲波和酶法等，通常提取效果的優(yōu)劣以提取率的高低來(lái)評(píng)價(jià)，但是，哪種提取方法提得的總黃酮清除自由基的能力最強(qiáng)，哪種提取方式提得的總黃酮總還原能力最大還沒(méi)有報(bào)道，本文研究了不同提取方式對(duì)板栗雄花序總黃酮清除自由基能力和總還原能力的影響，為科學(xué)高效地開發(fā)利用天然抗氧化劑使其發(fā)揮最大抗氧化效能提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

板栗雄花序 2011年7月采于河北懷柔，自然陰干；DPPH（1，1-dipheny-2-picrylhydrazyl radical 2，2-Diphenyl-1-（2，4，6-trinitrophenyl）hydrazyl） 美國(guó)SIGMA公司，分析純；硫酸亞鐵 天津市福晨化學(xué)試劑廠，分析純；磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、水楊酸、氯化鐵 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純；磷酸二氫鈉、過(guò)氧化氫、無(wú)水乙醇 北京化工廠，分析純。

TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HHS電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；LP-503電子天平

常熟市衡器廠；R-201真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 配有SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，上海申科機(jī)械研究所；FD-1D-80冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；PHS-3C酸度計(jì) 上海理達(dá)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 醇浸提法提取板栗雄花序中的黃酮類化合物采用乙醇熱回流浸提法提取板栗雄花序中的黃酮類化合物。乙醇濃度70%，浸提溫度60℃，料液比1∶30，原料粉碎度100～120目，回流提取2次，每次2h，提取液除去殘?jiān)笮D(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑。濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥得到板栗雄花序總黃酮粗提物樣品，放入干燥皿中備用。

1.2.2 微波法提取板栗雄花序中的黃酮類化合物微波萃取技術(shù)提取板栗雄花序中黃酮類物質(zhì)的適宜工藝條件為：乙醇濃度70%，微波功率800W，輻射時(shí)間3min，固液比1∶140，原料粉碎度100～120目，提取液除去殘?jiān)笮D(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑。濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥得到板栗雄花序總黃酮粗提物樣品，放入干燥皿中備用。

1.2.3 超聲波法提取板栗雄花序中的黃酮類化合物 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定了超聲波提取板栗雄花序中黃酮類物質(zhì)的最適條件，即乙醇濃度70%，料液比1∶30，原料粉碎度100～120目，超聲溫度50℃，超聲波功率400W，時(shí)間30min，提取液除去殘?jiān)笮D(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑。濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥得到板栗雄花序總黃酮粗提物樣品，放入干燥皿中備用。

1.2.4 酶法提取板栗雄花序中的黃酮類化合物 準(zhǔn)確稱取粉碎度為100～120目的板栗雄花序5g，加入100mL的水（按料液比1∶10），用稀鹽酸調(diào)節(jié)其pH為4.5，然后加入0.05%的果膠酶和0.05%的淀粉酶，50℃酶解1h后沸水浴中滅活10min，抽濾得上清液。濾雜加入150mL 70%的乙醇，60℃、100r/min水浴1h，提取液過(guò)濾后與酶解上清液合并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，濃縮液經(jīng)真空冷凍干燥得到板栗雄花序總黃酮粗提物樣品，放入干燥皿中備用。

1.2.5 黃酮濃度的測(cè)定

1.2.5.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取120℃干燥后并且恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.0157g，加入適量50%乙醇，稍加熱溶解，冷卻后用50%乙醇定容至50mL，搖勻備用，配成濃度為0.314mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.5.2 準(zhǔn)曲線的繪制及黃酮濃度的測(cè)定 以不同用量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用Al（NO3）3絡(luò)合顯色法[13]測(cè)定吸光度，繪制蘆丁含量—吸光度線圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A（吸光度）=2.0419×C（蘆丁含量，mg/mL）+0.0237，R2=0.9951。

精確吸取配制液0.5mL三份于3支具塞試管中，加50%乙醇補(bǔ)足至2.00ml，以后步驟同上。同時(shí)取0.5ml配制液，用50%乙醇補(bǔ)足至等體積，作為對(duì)照液，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算配制液中黃酮的濃度。對(duì)于濃度大的配制液先稀釋再按以上步驟測(cè)定其黃酮濃度。

1.2.6 清除DPPH自由基能力的測(cè)定 在Bao等[14]所建立方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，用60%乙醇配制質(zhì)量濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14mg/mL的Trobx溶液，DPPH用60%乙醇配制成2×10-4mol/L的溶液。取1mL不同濃度的樣品溶液與4mL 2×10-4mol/L的DPPH溶液于具塞試管中，搖勻反應(yīng)30min后，于517nm處測(cè)定吸光度值，用60%乙醇溶液作參比。取3次實(shí)驗(yàn)的平均值計(jì)算清除率。不同提取方式提得的板栗雄花序總黃酮以相同的濃度梯度做對(duì)DPPH自由基的清除能力。對(duì)DPPH自由基的清除率計(jì)算公式如下：

式中：A1表示4mL 2×10-4mol/L DPPH溶液加入1mL 60%乙醇溶液的吸光值；A2表示4mL 2×10-4mol/L DPPH溶液加入1mL樣品溶液的吸光值。

1.2.7 清除羥自由基（·OH）能力的測(cè)定 參照Smirnoff等[15]的方法，略做修改。用60%乙醇配制質(zhì)量濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1mg/mL的Trobx溶液，在10mL比色管中依次加入0.5mL 9mmol/L水楊酸-乙醇溶液，0.5mL 9mmol/L七水合硫酸亞鐵溶液，混勻，加入不同濃度的Trobx溶液2mL，加入4mL蒸餾水，混勻，最后加入8.8mmol/L H2O20.5mL啟動(dòng)反應(yīng)，37℃保溫30min，于510nm處測(cè)定吸光值。按下面公式計(jì)算不同濃度的黃酮溶液對(duì)·OH的清除率。不同提取方式提得的板栗雄花序總黃酮以相同的濃度梯度做對(duì)·OH的清除能力。·OH的清除能力計(jì)算公式如下：

式中：A1為加入樣液的吸光值；A2為蒸餾水代替H2O2的吸光值；A3為蒸餾水代替樣液的吸光值。

1.2.8 總還原力的測(cè)定[16-17]用60%乙醇將不同提取方式提得的板栗雄花序總黃酮粉末均配制成質(zhì)量濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25mg/mL的Trobx溶液，然后分別測(cè)定其不同提取方式提得的板栗雄花序總黃酮的還原力。取1mL不同濃度的Trobx溶液于試管中，依次加入2.5mL 0.2mmol/L磷酸緩沖液（PBS，pH6.6）和2.5mL 1%的鐵氰化鉀，搖勻，于50℃水浴保溫20min后，快速冷卻，再加入2.5mL 10%三氯乙酸溶液，以3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，依次加入2.5mL蒸餾水，0.5mL 0.1%氯化鐵溶液，充分混勻，10min后在700nm下測(cè)其吸光值，以蒸餾水代替樣品作空白。

2 結(jié)果與分析

2.1 板栗雄花序總黃酮清除DPPH自由基的能力

以醇浸提法獲得的板栗雄花序總黃酮作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。在一定濃度范圍內(nèi)，隨著板栗雄花序總黃酮試樣濃度的增大，對(duì)DPPH自由基的清除能力增大，并且濃度和清除率有很好的量效關(guān)系。半數(shù)抑制濃度IC50為0.068mg/mL，由此可見(jiàn)，板栗雄花序總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力很強(qiáng)，是一種很好的天然自由基清除劑。

圖1 板栗雄花序總黃酮清除DPPH自由基的能力Fig.1 Total flavonoids of the male chestnut flowers’sscavenging ability to DPPH free radical

2.2 提取方式對(duì)清除DPPH自由基能力的影響

圖2顯示，各種提取方式提得的板栗雄花序總黃酮對(duì)DPPH自由基的清除能力都較強(qiáng)，在一定濃度范圍內(nèi)，各提取方式提得的總黃酮均隨其濃度的增大，對(duì)DPPH自由基的清除能力增大。方差分析顯著水平達(dá)0.0704，在0.05的顯著水平下，各提取方式提得的總黃酮清除DPPH自由基的能力差異不顯著。其中醇浸提法提得的總黃酮清除DPPH自由基的能力最大，微波和超聲波提得的總黃酮清除DPPH自由基的能力基本一樣，且比醇浸提法提得的總黃酮清除DPPH自由基的能力略低，而酶法提取提得的總黃酮清除DPPH自由基的能力最低，而且提取條件要求較高。因此，綜合考慮提取黃酮的操作時(shí)間、溶劑消耗、提取效果等因素，在條件允許的情況下，應(yīng)選擇微波提取法，因?yàn)槲⒉ㄌ崛〔僮鲿r(shí)間短、溶劑消耗量少、提取率高、污染小，而且與其他提取方法相比，其提得的總黃酮清除DPPH自由基的能力也很強(qiáng)。

圖2 提取方式對(duì)清除DPPH自由基能力的影響Fig.2 Effect of extraction method to scavenging DPPH free radical

2.3 板栗雄花序總黃酮清除·OH的能力

以醇浸提法獲得的板栗雄花序總黃酮做標(biāo)曲，圖3顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著試樣濃度的增大，其對(duì)·OH的清除能力增大，并且濃度和清除率有很好的量效關(guān)系。半數(shù)抑制濃度IC50為0.492mg/mL，由此可見(jiàn)，板栗雄花序總黃酮對(duì)·OH的清除能力很強(qiáng)，是一種高效的天然自由基清除劑，可以添加到食品、藥品或保健品等中，幫助人類預(yù)防某些慢性病。

圖3 板栗雄花序總黃酮清除羥自由基（·OH）的能力Fig.3 Total flavonoids of the male chestnut flowers’s scavenging ability to Hydroxyl free radical

2.4 提取方式對(duì)清除羥自由基（·OH）能力的影響

圖4顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，各提取方式提得的板栗雄花序總黃酮隨其濃度的增大，對(duì)·OH的清除力增大。方差分析顯著水平達(dá)0.0287，在0.05的顯著水平下，各提取方式提得的板栗雄花序總黃酮清除·OH能力差異顯著。醇浸提法提得的總黃酮對(duì)·OH的清除能力最大，微波提取法提得的總黃酮對(duì)·OH的清除力略有降低，超聲波提取法提得的總黃酮對(duì)·OH的清除力明顯降低，而酶法提取提得的總黃酮對(duì)·OH的清除力最低。因此，板栗雄花序總黃酮作為天然·OH清除劑使用時(shí)，如果為了使其發(fā)揮最大·OH清除力，應(yīng)選擇醇浸提法；如果考慮經(jīng)濟(jì)效益和環(huán)境效益，應(yīng)選擇微波提取法，微波提取法與其他方法相比，既節(jié)省資源又環(huán)保，而且其提取物清除·OH的能力比醇浸提法略微降低一些，其清除·OH的能力也較強(qiáng)。

圖4 提取方式對(duì)清除羥自由基（·OH）能力的影響Fig.4 Effect of extraction method to scavenging Hydroxyl free radical

2.5 板栗雄花序總黃酮的總還原力

以醇浸提法獲得的板栗雄花序總黃酮做標(biāo)曲，圖5顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著試樣濃度的增大，其吸光值增大，濃度和吸光值具有很好的量效關(guān)系。與空白相比，當(dāng)試樣的濃度為0.25mg/mL時(shí)，吸光值達(dá)到0.7，由此可見(jiàn)，板栗雄花序總黃酮具有很強(qiáng)的還原性，即具有很強(qiáng)的抗氧化性，是一種高效的天然抗氧化劑，值得深入研究及開發(fā)利用。

圖5 板栗雄花序總黃酮的總還原力Fig.5 Total flavonoids of the male chestnut flowers’s total reduction capacity

2.6 提取方式對(duì)板栗雄花序總黃酮總還原力的影響

圖6顯示，在一定的濃度范圍內(nèi)，隨各提取方式提得的總黃酮濃度的增大，其吸光值均增大，且都有很好的量效關(guān)系。方差分析顯著水平達(dá)0.3162，在0.05的顯著水平下，各提取方式提得的板栗雄花序總黃酮的還原力差異顯著。各提取方式提得的總黃酮還原力的大小順序?yàn)椋何⒉ㄌ崛》ǎ敬冀岱ǎ境暡ㄌ崛》ǎ久柑崛》āＲ虼税謇跣刍ㄐ蚩傸S酮作為抗氧化劑開發(fā)利用時(shí)，應(yīng)選擇微波提取法，因?yàn)槲⒉ㄌ崛》ㄌ岬玫陌謇跣刍ㄐ蚩傸S酮具有最大抗氧化效能，而且與其他方法比較，微波提取法具有許多優(yōu)點(diǎn)，順應(yīng)當(dāng)前國(guó)家經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展趨勢(shì)。

圖6 提取方式對(duì)板栗雄花序總黃酮總還原力的影響Fig.6 Effect of extraction method to total flavonoids of the male chestnut flowers's total reduction capacity

3 結(jié)論

3.1 不同提取方式提得的板栗雄花序總黃酮清除DPPH自由基能力差異較小，而清除·OH能力和總還原力差異顯著。

3.2 提取方式對(duì)板栗雄花序總黃酮清除自由基的能力和總還原力的影響不一致，不同提取方式提得的板栗雄花序總黃酮清除自由基的能力大小依次為：醇浸提法＞微波法＞超聲波法＞酶法；總還原力的大小順序?yàn)椋何⒉ㄌ崛》ǎ敬冀岱ǎ境暡ㄌ崛》ǎ久柑崛》?，因此，不同提取方式提得的黃酮類化合物的提取率及黃酮種類都不同。

3.3 提取天然黃酮類化合物時(shí)，應(yīng)綜合考慮提取時(shí)間、能源消耗，環(huán)境污染，提取物效能的發(fā)揮等因素，之后選擇最佳的提取方式。如果要使提得的天然黃酮類化合物發(fā)揮最大抗氧化效能，應(yīng)針對(duì)不同的抗氧化使用范疇選擇不同的提取方式。

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