劉春秀 滿大鵬 杜曉巖 康寧 董平 肖苒 王麗穎

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （Human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）是組織工程重要的種子細(xì)胞，來源廣泛，取材方便，但在骨髓中的含量很少。目前，應(yīng)用生長因子促進(jìn)BMSCs體外擴(kuò)增及成骨分化的研究取得了一定成果，同時(shí)也暴露出一些問題，如生長因子不易人工合成、價(jià)格昂貴，需要通過構(gòu)建不同的載體才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用等。ODN是指含有50個(gè)以下核苷酸單體的多核苷酸鏈，具有高效低毒、性質(zhì)穩(wěn)定、易于合成等優(yōu)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，人工合成的ODN能夠顯著促進(jìn)大鼠BMSCs的增殖及成骨分化，并且能夠促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞、人成骨樣細(xì)胞、人牙周膜干細(xì)胞及脂肪干細(xì)胞的增殖[1-4]，本實(shí)驗(yàn)選取一種前期研究中作用明顯的ODN進(jìn)行研究，觀察其對人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及成骨分化的影響，為ODN用于骨組織工程種子細(xì)胞擴(kuò)增與成骨分化的可行性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器及材料

倒置熒光顯微鏡（Nikon公司），流式細(xì)胞儀（BD公司），多標(biāo)記微孔板檢測系統(tǒng)（PerkinElmer公司）。

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（北京協(xié)和醫(yī)院整形外科醫(yī)院研究中心惠贈(zèng)），寡核苷酸（吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院王麗穎教授惠贈(zèng)，大連寶生物公司合成），F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液（GE Healthcare公司），干細(xì)胞培養(yǎng)基（Sciencell公司），DMEM 低糖培養(yǎng)基、DMEM 高糖培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液、胰蛋白酶、磷酸鹽緩沖液（Hyclone公司），特級胎牛血清（GIBCO公司），CCK-8（Dojindo研究所，日本），堿性磷酸酶試劑盒（南京建成研究所）。

1.2 方法

1.2.1 hBMSCs體外分離、培養(yǎng)及鑒定

自患者髂前上棘抽取5 mL骨髓血（獲知情同意，患者各項(xiàng)指標(biāo)均正常），F(xiàn)icoll梯度密度離心法收取單核細(xì)胞層，用10 mL干細(xì)胞培養(yǎng)基吹打混勻，接種至75 cm2的培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱孵育，待細(xì)胞匯合至80%～90%時(shí)，1∶3傳代，觀察細(xì)胞形態(tài)；傳代后，取第2代生長良好的hBMSCs，消化離心，用含1%BSA的PBS洗滌3次后計(jì)數(shù)， 分別加入 CD73、CD90、CD105、CD34 單克隆抗體，同時(shí)每管樣品設(shè)立同型陰性對照，避光冰上孵育45min，用含1%BSA的PBS洗滌細(xì)胞3次，以除去未結(jié)合抗體，用200μL含1%BSA的PBS重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測分析；第3代hBMSCs匯合至80%～90%后，消化離心，以5000/cm2的密度接種至6孔板中，待細(xì)胞匯合至60%～70%后分別更換成骨（LG-DMEM，10%胎牛血清，1%青鏈霉素，10 mM β-甘油磷酸鈉，10-8M地塞米松，0.05 mM維生素C）及成脂誘導(dǎo)液（HG-DMEM，10%胎牛血清，1%青鏈霉素，10-7M地塞米松，10 μM胰島素，0.5 mM吲哚美辛，0.5 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤），72 h換液一次；取細(xì)胞懸液滴至6孔板中的細(xì)胞爬片上，貼壁后加入完全培養(yǎng)基，第2天更換成軟骨誘導(dǎo)液（LG-DMEM，1%胎牛血清，1%青鏈霉素，10 μg/L TGF-β1，0.1 M L-脯氨酸，1× ITS），72 h 換液一次。

1.2.2 ODN MT01對hBMSCs體外擴(kuò)增的影響

第3代hBMSCs匯合至80%～90%時(shí)，消化離心，干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸，并計(jì)數(shù)，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2000個(gè)/孔，接種至96孔板中，對照組和實(shí)驗(yàn)組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔，周圍孔加PBS以防止邊緣效應(yīng)產(chǎn)生。24h細(xì)胞全部貼壁后，實(shí)驗(yàn)組加入1 μg/mL ODN MT01（5'-ACCCCCTCTACCCCCTCTACCCCCTCT-3'），對照孔加入等量PBS。48 h換液一次，24h取一板，將10μL CCK-8加入各孔中，37℃避光孵育4h，多標(biāo)記微孔板檢測系統(tǒng)檢測。

1.2.3 ODN MT01對hBMSCs成骨分化的影響

當(dāng)?shù)?代hBMSCs匯合至80%～90%時(shí)，消化離心，用完全培養(yǎng)基重懸，并細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為8000個(gè)/孔接種至六孔板，對照組和實(shí)驗(yàn)組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，待細(xì)胞完全貼壁后換成骨誘導(dǎo)液，實(shí)驗(yàn)組加入 1 μg/mL ODN MT01，對照孔加入等量 PBS，72 h換液一次，于第4、7、14、21天 用ALP試劑盒檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行處理，均采用多樣本單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長與形態(tài)學(xué)特征

倒置顯微鏡下觀察，原代細(xì)胞培養(yǎng)24h可見圓形透明的細(xì)胞貼壁，4 d后見細(xì)胞呈集落樣生長，細(xì)胞逐漸伸展開，呈單核的小多角形或短梭形，8～10 d后細(xì)胞可達(dá)80%匯合，且出現(xiàn)細(xì)胞聚集成群現(xiàn)象，傳代后細(xì)胞生長逐漸穩(wěn)定，3～4 d可形成單層匯合，細(xì)胞分布呈束狀或漩渦狀（圖1）。流式細(xì)胞儀檢測CD73、CD90、CD105表達(dá)呈陽性，陽性率分別為94.4%、91.3%、87.8%；CD34表達(dá)陰性，陽性率為0.04%（圖2）。成骨誘導(dǎo)14 d后，茜素紅染色可見礦化結(jié)節(jié)；成脂誘導(dǎo)后14 d，油紅O染色可見脂滴；成軟骨誘導(dǎo)14 d，甲苯胺藍(lán)染色可見藍(lán)色異染顆粒，細(xì)胞外基質(zhì)染成淺藍(lán)色的軟骨細(xì)胞（圖1）。

2.2 ODN MT01對hBMSCs體外擴(kuò)增的影響

檢測hBMSCs接種后7 d的OD值，發(fā)現(xiàn)ODN MT01組在第3、4、5天的OD值與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05），第6、7 d的OD值與對照組差異明顯（P>0.01）（圖 3）。

2.3 ODN MT01對hBMSCs成骨分化的影響

成骨誘導(dǎo)后第4、7、14、21 d的堿性磷酸酶吸光度值分析發(fā)現(xiàn)，成骨誘導(dǎo)第 4、14、21天，ODN MT01組ALP的OD值與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第7天實(shí)驗(yàn)組與對照組相比無明顯差別（圖4）。

圖1 hBMSCs形態(tài)學(xué)觀察及多向分化鑒定Fig.1 Morphology observation and multi-differentiation identification of hBMSCs

圖2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)Fig.2 The expression of surface markers of human bone marrow mesenchymal stem cells

圖3 ODN MT01對hBMSCs增殖的影響（*：與對照組比較 P<0.05；**：與對照組比較 P<0.01）Fig.3 The influences of ODN MT01 on the proliferation of hBMSCs(*:vs control group P<0.05;**:vs control group P<0.01)

3 討論

BMSCs是骨組織工程重要的種子細(xì)胞，梯度密度篩選法分離BMSCs雖然操作繁瑣，但純度較高[5]。2006年，國際間充質(zhì)干細(xì)胞委員會(huì)提出了MSCs的三條最低標(biāo)準(zhǔn)：塑料黏附性、特定的表面抗原表達(dá)和多向分化潛能[6]。本實(shí)驗(yàn)利用Ficoll梯度密度離心法分離純化hBMSCs后，從形態(tài)學(xué)觀察、表面標(biāo)志物檢測及多向誘導(dǎo)鑒定三方面證實(shí)了所分離純化出的細(xì)胞具備干細(xì)胞特征。

圖4 ODN MT01作用于hBMSCs第 4、7、14、21天 ALP表達(dá)OD值比較（*：與對照組相比P<0.05）Fig.4 Comparison of ALP activity of hBMSCs deal with ODN MT01 at 4,7,14,21 day(*:P<0.05,vs control group)

BMSCs增殖和成骨分化因子的研究，如成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）[7-8]、骨形成蛋白 2（BMP2）[9-10]、富血小板血漿（PRP）[11-12]等，都取得了一定的成果。但大多因子需要載體運(yùn)載，價(jià)格昂貴。ODN存在于自然界某些低等生物基因組的DNA中，且哺乳動(dòng)物本身的DNA分子不具有免疫刺激作用[13-15]。根據(jù)ODN的免疫調(diào)節(jié)作用，可將其分為3型：免疫刺激性的CpG ODN、中和性CpG ODN和不含CG基序的抑制性O(shè)DN。CpG ODN目前被廣泛研究，在哮喘、變態(tài)反應(yīng)性疾病、感染性疾病和腫瘤的治療中效果良好[16-18]；不含CG基序的抑制性O(shè)DN MT01能夠調(diào)控一些重要成骨相關(guān)因子，如TNF-α、IFN-γ、RANKL、OPG、Osterix等，改變成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的平衡影響骨代謝過程[1，19]。本實(shí)驗(yàn)將人工合成的ODN MT01直接加入到干細(xì)胞培養(yǎng)基中，能夠持續(xù)穩(wěn)定促進(jìn)hBMSCs的增殖，加入到成骨誘導(dǎo)液中能夠有效增強(qiáng)堿性磷酸酶活性，特別是在14 d后，常規(guī)成骨誘導(dǎo)液中的細(xì)胞ALP活性降低，而ODN組的ALP活性仍能維持在較高水平，成骨活性較強(qiáng)，可能是ODN促進(jìn)了細(xì)胞的增殖,使細(xì)胞數(shù)量增加，也可能是ODN通過調(diào)控成骨相關(guān)因子促進(jìn)成骨分化，或兩者共同作用的結(jié)果。

綜上所述，特定濃度的ODN MT01對hBMSC的體外擴(kuò)增和成骨分化具有一定的促進(jìn)作用，但是關(guān)于ODN MT01促進(jìn)hBMSC的增殖和成骨分化的機(jī)制尚未明確，我們將進(jìn)行更為深入的研究。

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