孟亮 葛華 蔣紅軍 趙東暉 車行素

血管重構(gòu)（Vascular remodeling，VR）是血管為適應(yīng)體內(nèi)外環(huán)境變化而發(fā)生的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能改變的動(dòng)態(tài)反應(yīng)過(guò)程，包括細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和細(xì)胞基質(zhì)的合成、降解及重排等一系列的動(dòng)態(tài)變化，與高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化以及血管術(shù)后再狹窄等多種心血管疾病密切相關(guān)。缺血、缺氧和機(jī)械損傷等引起的血管平滑肌細(xì)胞損傷、凋亡和壞死是血管重構(gòu)類疾病的常見(jiàn)病理改變[1]。在病理?xiàng)l件下，壞死的血管平滑肌細(xì)胞能夠分泌多種炎性因子，并刺激周圍正常細(xì)胞，引起細(xì)胞增殖。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，壞死的血管平滑肌細(xì)胞上清液能夠顯著增強(qiáng)正常血管平滑肌細(xì)胞的增殖能力[2]，但機(jī)制不明確。本實(shí)驗(yàn)擬采用壞死細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為條件培養(yǎng)液，進(jìn)一步探討壞死細(xì)胞培養(yǎng)上清液的促炎和促進(jìn)細(xì)胞增殖的機(jī)制，以期為心血管疾病的恢復(fù)及治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑

人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所）；IL-1、IL-1RA（Prospec 公司），MTT、DMSO（Sigma 公司），總 RNA提取試劑盒、TIAN Script cDNA第一鏈合成試劑盒（北京天根生化科技有限公司），細(xì)胞核細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（碧云天公司），NF-kB抗體、IkB抗體（Santa Cruz公司），引物委托生工生物（上海）有限公司合成，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。2～3 d更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%融合時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3 壞死細(xì)胞培養(yǎng)上清液的制備及實(shí)驗(yàn)分組

按照文獻(xiàn)[2]的方法，將無(wú)血清無(wú)糖培養(yǎng)基通入5%CO2、10%H2、85%N2混合氣體飽和 15min， 即制成無(wú)血清無(wú)糖低氧溶液。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的血管平滑肌細(xì)胞接種于此條件溶液后，置于含上述混合氣體的厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后離心收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，即為壞死血管平滑肌細(xì)胞上清液。實(shí)驗(yàn)設(shè)置壞死上清干預(yù)組(NCS)、IL-1干預(yù)組(IL-1)、壞死上清與IL-1RA聯(lián)合干預(yù)組（NCS+IL-1RA）以及無(wú)血清低糖DMEM培養(yǎng)的對(duì)照組（Control）。

1.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的血管平滑肌細(xì)胞以5000個(gè)/孔的濃度接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后無(wú)血清同步化于G0期。換液為各組條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。每孔加入20μL濃度為5 mg/mL的MTT，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h，吸去上清，加入200μL DMSO溶解細(xì)胞形成的結(jié)晶。酶標(biāo)儀上測(cè)定各組細(xì)胞在490 nm處的OD值，分析細(xì)胞增殖情況。

1.5 RT-PCR

培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞。TRIzol法提取總RNA，按照cDNA第一鏈合成試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以管家基因β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行PCR反應(yīng)，MCP-1的上、下游引物為：5'-CAATCAATGCCCCAGTCACCT-3'，5'-AATCCTGAACCCACTTCTGCTT-3'；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為177 bp。IL-6的上、下游引物序列分別為：5'-AATAACCACCCCT GACCCAAC-3'，5'-CCAGAAGAAGGAATGCCCATT-3'；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為198 bp。IL-8的上、下游引物序列為：5'-AGGAATTGAATGGGTTTGC-3'，5'-CTGTGAGGTAAGATGGTGGCTAA-3'；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為229 bp。β-actin的上、下游引物序列為：5'-ACGTTGACATC CGTAAAGAC-3'，5'-GAAGGTGGACAGTGAGGC-3’；擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為200 bp。采用2×Taq PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：cDNA 模板 2μL，上、下游引物各1μL，2×Taq PCR Master-mix 10μL，ddH2O 補(bǔ)足總體積至20μL。 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 5min，95 ℃變性20 sec；57℃退火 20 sec；72℃延伸 30 sec，共 30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min，反應(yīng)結(jié)束后于1.5%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)將圖片掃描入電腦并進(jìn)行灰度分析。

1.6 IL-6、MCP-1和IL-8表達(dá)檢測(cè)

培養(yǎng)48h后收集各組細(xì)胞的上清液，采用ELISA檢測(cè)各組IL-6、MCP-1和IL-8的表達(dá)。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各組樣品在450 nm處的吸光值計(jì)算IL-6、MCP-1和IL-8的含量，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.7 Western blot

按試劑盒說(shuō)明書(shū)抽提各組細(xì)胞的核蛋白及胞漿蛋白，BCA法定量蛋白。利用上樣緩沖液調(diào)平蛋白，100℃煮沸5min使蛋白變性。配置聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE。電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜置于5%脫脂奶粉中封閉，加入一抗后4℃孵育過(guò)夜，TTBS洗膜4次，加入稀釋的二抗后，37℃孵育45min。ECL底物發(fā)光法曝光膠片，并掃描入電腦，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 壞死細(xì)胞上清液對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響

以O(shè)D值表示各組細(xì)胞的增殖能力，NCS組和IL-1組細(xì)胞增殖能力均顯著高于對(duì)照組（P<0.01），NCS+IL-1 β組細(xì)胞增殖能力顯著低于NCS組和IL-1 組，差異具有顯著性（P<0.01）（圖 1）。

圖1 細(xì)胞增殖能力的比較Fig.1 Comparison of cell proliferation

2.2 壞死細(xì)胞上清液對(duì)MCP-1、IL-6和IL-8 mRNA表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果表明，NCS組和IL-1組MCP-1、IL-8、IL-6的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 NCS+IL-1組 MCP-1、IL-6和IL-8的表達(dá)均顯著低于NCS組和IL-1組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖 2）。

2.3 壞死細(xì)胞上清液對(duì)MCP-1、IL-6、IL-8的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果提示，各組MCP-1、IL-6和IL-8的分泌情況與mRNA的表達(dá)結(jié)果基本一致，即NCS組和IL-1組顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。NCS+IL-1RA 組 MCP-1、IL-6和 IL-8的分泌顯著低于NCS組和IL-1組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖 3）。

2.4 壞死細(xì)胞上清液對(duì)NF-kB活性的影響

NCS組和IL-1組核蛋白中NF-kB的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.05），NCS+IL-1RA組則顯著低于NCS組和IL-1組（P<0.05）。與對(duì)照組相比，NCS組和IL-1組的表達(dá)顯著降低（P<0.01），NCS+IL-1組顯著高于 NCS組和IL-1組（P<0.05）（圖 4）。

圖2 MCP-1、IL-6和IL-8 mRNA的表達(dá)Fig.2 mRNA expression of MCP-1,IL-6 and IL-8

圖3 MCP-1、IL-6和IL-8的表達(dá)Fig.3 Expression of MCP-1,IL-6 and IL-8

圖4 各組NF-kB的活性Fig.4 NF-kB activity

3 討論

正常生理?xiàng)l件下，血管平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡保持動(dòng)態(tài)平衡，病理?xiàng)l件下內(nèi)環(huán)境中某些因子的改變會(huì)導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞的增殖失控，是臨床常見(jiàn)心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。血管平滑肌細(xì)胞存在兩種不同的表型，即收縮型和合成型。收縮型在神經(jīng)及激素的影響下調(diào)節(jié)血管壁張力，維持組織的血流量；合成型血管平滑肌細(xì)胞能夠在血管壁的形成和損傷修復(fù)，以及生長(zhǎng)因子的刺激下，進(jìn)行分裂和增殖。在生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)、機(jī)械性作用力和細(xì)胞間的相互作用下，收縮型血管平滑肌細(xì)胞向合成型轉(zhuǎn)變，是血管平滑肌細(xì)胞病理性增殖的主要表現(xiàn)[3]。

IL-1調(diào)控多種炎癥因子和生長(zhǎng)因子的表達(dá)，是冠狀動(dòng)脈重構(gòu)過(guò)程中主要的活性細(xì)胞因子之一[4]，在血管損傷后的新生內(nèi)膜中表達(dá)增加，表明IL-1在新生內(nèi)膜的形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[5-6]。內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌IL-1β，進(jìn)一步誘導(dǎo)了細(xì)胞因子的表達(dá)，激活細(xì)胞黏附和增殖能力，是動(dòng)脈粥樣硬化和術(shù)后再狹窄等病變的關(guān)鍵[7]，IL-1β基因敲除小鼠，動(dòng)脈粥樣硬化癥狀明顯減輕[8]，表明IL-1β在重塑類血管病變中發(fā)揮著重要作用。壞死的血管平滑肌細(xì)胞能夠釋放IL-1α和β，并促進(jìn)周圍細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子[9]。本實(shí)驗(yàn)中，壞死細(xì)胞上清液和IL-1都顯著促進(jìn)正常細(xì)胞增殖和炎性因子的表達(dá)；而在壞死上清中加入IL-1RA，則明顯抑制了其促增殖和促炎性分子分泌的作用。據(jù)此推測(cè)，壞死的血管平滑肌細(xì)胞可能釋放大量IL-1，進(jìn)而促進(jìn)了周圍正常細(xì)胞的增殖以及炎性因子的表達(dá)。

單核細(xì)胞趨化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和IL-8是主要作用于單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的趨化因子，分別促進(jìn)單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的遷移和轉(zhuǎn)化，能夠損傷內(nèi)皮細(xì)胞，分泌炎性因子，加劇血管壁內(nèi)的炎癥反應(yīng)，在動(dòng)脈粥樣硬化等血管疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中，NCS組和 IL-1組MCP-1、IL-6和IL-8的表達(dá)增加，而壞死上清中加入IL-1RA能夠降低其表達(dá)，提示壞死細(xì)胞可能通過(guò)釋放IL-1而加重周圍正常細(xì)胞的炎性反應(yīng)。

NF-kB是炎癥反應(yīng)的核心調(diào)節(jié)因子，血管炎癥反應(yīng)過(guò)程中的許多基因都是受NF-kB激活的。NF-kB可介導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生各種細(xì)胞因子、黏附分子和生長(zhǎng)因子，影響細(xì)胞周期和凋亡，促使平滑肌細(xì)胞增生并向內(nèi)膜下遷移[12]。本實(shí)驗(yàn)中，NCS組和IL-1組NF-kB活性增強(qiáng)，而NCS中加入IL-1RA顯著抑制了NF-kB的活性，表明壞死細(xì)胞可能通過(guò)釋放IL-1而激活NF-kB，進(jìn)一步誘導(dǎo)了多種細(xì)胞因子的釋放。

[1]Kavurma MM,Bhindi R,Lowe HC,Chesterman C,et al.Vessel wall apoptosis and atherosclerotic plaque instability[J].Thromb Haemost,2005,3(3):465-472.

[2]Liang Meng,Bo Yu.Oxygen-and glucose-deprived culture promotes cell proliferation and inbasion of vascular smooth muscle cells[J].International Journal of Molecular Medicine,2011,28(5):777-783.

[3]Padro T,Mesters RM,Dankbar B,et al.The catalytic domain of endogenous urokinase-type plasminogen actibator is required for the mitogenic activity of platelet-derived and basic fibroblast growth factors in human vascular smooth muscle cells[J].J Cell Sci,2002,115(9):1961-1971.

[4]Taglieri C,Lombardo E,Feola M,et al.Prevention of left ventricular remodeling after myocardial infarction:efficacy of physical training[J].Monaldi Arch Chest Dis,2008,70(2):51-58.

[5]Ohashi N,Matsumori A,Furukawa Y,et al.Role of p38 mitogenactivated protein kinase in neointimal hyperplasia after vascular injury[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20(12):2521-2526.

[6]I Isoda K,Shiigai M,Ishigami N,et al.Deficiency of interleukin-1 receptor antagonist promotes neointimal formation after injury[J].Circulation,2003,108(5):516-518.

[7]Fearon WF,Fearon DT.Inflammation and cardiovascular disease:role of the interleukin-1 receptor antagonist[J].Circulation,2008,117(20):2577-2579.

[8]Chamberlain J,Evans D,King A,et al.Interleukin-1 beta and signaling of interleukin-1 in vascular wall and circulating cells modulates the extent of neointima formation in mice[J].Am J Pathol,2006,168(4):1396-1403.

[9]Murray CH,Sara Talib,Nichola L,et al.Vascular smooth muscle cell apoptosis induces interleukin-1-directed inflammation:effects of hyperlipidemia-mediated inhibition of phagocytosis[J].Circulation Research,2010,106(2):363-372.

[10]Kim HY,Kang YJ,Song IH,et al.Upregulation of interleukin-8/CXCL8 in vascular smooth muscle cells from spontaneously hypertensive rats[J].Hypertens Res,2008,31(3):515-523.

[11]Wang M,Monticone RE,Lakatta EG.Arterial aging:a journey into subclinical arterial disease[J].Curr Opin Nephrol Hypertens,2010,19(2):201-207.

[12]Brand K,Page S,Rogler G,et al.Activated transcription factor nuclear factor kappa B is present in the atherosclerotic lesion[J].J Clin Invest,1996,97(7):1715-1722.