彭 萍 何力志 彭 鑫 張 裕 焦芳艷

（1.湖南省腦科醫(yī)院（湖南省臨床檢驗(yàn)中心免疫室） 湖南長沙 410007；2.羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司）

1 前言

我國是乙肝病毒（HBV）感染大國，據(jù)統(tǒng)計(jì)我國約有1 億人攜帶HBV，HBV 是我國肝炎患者的主要誘導(dǎo)原因， 若不能及時(shí)診斷治療， 可能會(huì)引起肝硬化，甚至是肝癌[1，2]。HBV DNA 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)技術(shù)具有高靈敏性和高特異性，可定量HBV DNA 水平，從而反應(yīng)HBV 的傳染性，對(duì)臨床上評(píng)價(jià)抗HBV 藥物的臨床效果和預(yù)后判定具有重要意義[3，4]。 國際標(biāo)準(zhǔn)品HBV DNA 定量檢測(cè)試劑盒是國際上公認(rèn)的檢測(cè)試劑盒，具有高靈敏度、高特異性，但價(jià)格昂貴，給患者帶來了一定的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5]。 國產(chǎn)試劑盒可減輕患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，但目前生產(chǎn)種類較多，靈敏度、線性范圍、特異性存在明顯差異[6]。 本文選取3 種不同國產(chǎn)超敏HBV 定量檢測(cè)試劑盒，分析3 種國產(chǎn)試劑盒的準(zhǔn)確性，并分別與國際標(biāo)準(zhǔn)品HBV DNA 定量檢測(cè)試劑盒通過相關(guān)性和一致性進(jìn)行評(píng)價(jià)分析。

2 研究對(duì)象與方法

2.1 研究對(duì)象

收集HBV 感染患者的血漿210 份，所有患者均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015 年版）》診斷標(biāo)準(zhǔn)，均為單一HBV 感染患者。

2.2 主要材料

WHO 國際標(biāo)準(zhǔn)品4th WHO International Standard for HBV DNA for NAT （10/266）。 標(biāo)準(zhǔn)HBV DNA檢測(cè)試劑盒（瑞士羅氏診斷產(chǎn)品有限公司，批號(hào)：251559）；國產(chǎn)HBV DNA 檢測(cè)試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，批號(hào)：2018005）；國產(chǎn)HBV DNA 檢測(cè)試劑盒（湖南圣湘科技有限公司，批號(hào)：2018004）；國產(chǎn)HBV DNA 檢測(cè)試劑盒（廈門安普利生物工程有限公司，批號(hào)：201804015）。 國際標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)試劑盒采用COBAS Am-pliPrep 提取儀、擴(kuò)增試劑為COBAS HBV Testv2.0（瑞士，Roche）；國產(chǎn)HBV 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)方法采用Smart 32 全自動(dòng)核酸提取；采用超敏PCR 擴(kuò)增試劑（國產(chǎn)中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司），熒光定量PCR 儀（美國ABI 7500 型）；PCR 分析儀（Roche 公司，COBAS Ampliprep/COBASTaqMan 48 II）。 3 種試劑盒自帶陽性標(biāo)準(zhǔn)品定量范圍詳見表1。

表1 3 種試劑盒自帶陽性標(biāo)準(zhǔn)品定量范圍

2.3 檢測(cè)方法

210 份HBV 患者血漿標(biāo)本均采用國際標(biāo)準(zhǔn)HBV DNA 檢測(cè)試劑盒及A、B、C 國產(chǎn)HBV DNA 檢測(cè)試劑盒，對(duì)3 種國產(chǎn)試劑盒的準(zhǔn)確性和精密度進(jìn)行驗(yàn)證[6]，按照試劑盒檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，各檢測(cè)試劑盒特征詳見表2。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS26.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，陽性檢出率采用構(gòu)成比[n（%）]表示，spearman 相關(guān)分析不同國產(chǎn)品牌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒與國際標(biāo)準(zhǔn)HBV DNA 檢測(cè)試劑盒的相關(guān)性，采用Bland-Altman分析同國產(chǎn)品牌實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒與國際標(biāo)準(zhǔn)HBV DNA 檢測(cè)試劑盒的一致性，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 3 種國產(chǎn)試劑盒準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果比較

A、B、C 3 種試劑盒檢測(cè)陰性樣本3 次結(jié)果均為0 IU/mL，準(zhǔn)確度評(píng)估結(jié)果均為通過，詳見表3。

表3 3 種國產(chǎn)試劑盒準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果比較

3.2 3 種國產(chǎn)試劑盒精密度比較

A、B、C 3 種國產(chǎn)試劑盒的精密度符合要求，符合檢測(cè)濃度對(duì)數(shù)值的變異系數(shù)（CV）＜5%，批內(nèi)精密度s≤3/5Ea（0.24），且A（CV%）＞B（CV%）＞C（CV%），詳見表4。

3.3 4 種不同HBV DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果比較

本次研究共檢測(cè)210 份HBV 患者血漿樣本。國際HBV DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果如下，共檢出167 例（79.5%）患者為陽性，A國產(chǎn)HBV DNA 檢測(cè)試劑盒陽性檢出166 例（79.0%）患者為陽性，B 國產(chǎn)HBV DNA 檢測(cè)試劑盒陽性檢出163 例（77.6%）患者為陽性，C 國產(chǎn)HBV DNA 檢測(cè)試劑盒陽性檢出160 例（76.2%）患者為陽性，經(jīng)比較4 種不同HBV DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒陽性檢出率，統(tǒng)計(jì)量χ2值為0.835，P 值為0.841，組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 3 種國產(chǎn)試劑盒精密度結(jié)果

3.4 4 種不同HBV DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性比較

在20～1.7×108IU/mL 區(qū)間內(nèi)將A、B、C 3 種國產(chǎn)試劑盒與國際HBV DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的結(jié)果，進(jìn)行相關(guān)性分析，分析結(jié)果顯示A、B、C 3 種國產(chǎn)HBV DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的結(jié)果與國際HBV DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的結(jié)果相關(guān)系數(shù)r 分別為0.981、0.976、0.979、0.973，P 均小于0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），詳見表5。

表5 4 種HBV DNA 檢測(cè)實(shí)時(shí)定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性

3.5 4 種不同HBV DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致性比較

在20～1.7×108IU/mL 內(nèi)將A、B、C 3 種國產(chǎn)HBV DNA 與國際HBV DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)的結(jié)果，進(jìn)行一致性分析，Bland-Altman 分析結(jié)果顯示，A 國產(chǎn)HBV DNA 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒與國際HBV DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒定量值差值平均值為0.162log 10 IU/mL，95%可信區(qū)間為（-0.677 3～1.056 1）log10 IU/mL，98.1%（149/152）的樣本檢測(cè)值在95%可信區(qū)間內(nèi)。B 國產(chǎn)HBV DNA 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒與國際HBV DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒定量值差值平均值為0.159log10 IU/mL，95%可信區(qū)間為（-0.612 1～1.023 1）log10 IU/mL，95.6%（151/158）的樣本檢測(cè)值在95%可信區(qū)間內(nèi)。 C 國產(chǎn)HBV DNA 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒與國際HBV DNA 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒定量值差值平均值為0.169log10 IU/mL，95%可信區(qū)間為（-0.599 1～1.032 4）log10 IU/mL，98.6%（145/147）的樣本檢測(cè)值在95%可信區(qū)間內(nèi)，詳見表6。

表6 3 種HBV DNA 檢測(cè)實(shí)時(shí)定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果一致性

4 討論

HBV 實(shí)時(shí)熒光PCR 定量檢測(cè)試劑盒已廣泛應(yīng)用于乙肝患者的臨床診斷，其準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好被認(rèn)為是HBV DNA 定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)[7，8]。 國際HBV DNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒具有高靈敏度、高精密度等優(yōu)點(diǎn)，但價(jià)格昂貴、所需樣本量大、耗時(shí)長在中小醫(yī)院難以普及[9]。 因此，開發(fā)國產(chǎn)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒用于HBV DNA 定量檢測(cè)具有重要的臨床意義。

本次研究選取3 種不同國產(chǎn)HBV 實(shí)時(shí)熒光PCR 定量檢測(cè)試劑盒與進(jìn)口的國際標(biāo)準(zhǔn)HBV 實(shí)時(shí)熒光PCR 定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行比較，首先對(duì)3 種國產(chǎn)試劑盒進(jìn)行準(zhǔn)確度和精密度性能確認(rèn)，結(jié)果表明A、B、C 3 種國產(chǎn)試劑盒準(zhǔn)確度和精密度良好，從精密度數(shù)據(jù)看A（CV%）＞B（CV%）＞C（CV%），由此可知C 國產(chǎn)試劑盒精密度最好，性能確認(rèn)數(shù)據(jù)表明3 種國產(chǎn)試劑盒準(zhǔn)確性良好。 3 種檢測(cè)試劑盒的提取方法一致，均從血漿中提取，在模板上獲取效率一致，由表1 可以看出國產(chǎn)試劑盒的檢測(cè)限和檢測(cè)范圍均高于進(jìn)口國際標(biāo)準(zhǔn)試劑盒。通過比較A、B、C 國產(chǎn)試劑盒與國際標(biāo)準(zhǔn)試劑盒的陽性檢出率發(fā)現(xiàn)，國產(chǎn)試劑盒與國際標(biāo)準(zhǔn)試劑盒的檢出率基本一致。 比較國產(chǎn)試劑盒與國際標(biāo)準(zhǔn)試劑盒檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性和一致性發(fā)現(xiàn)在20～1.7×108IU/mL 相關(guān)性和一致性均較好。 本次研究選取了3 個(gè)不同廠家的國產(chǎn)試劑盒與國際標(biāo)準(zhǔn)試劑盒進(jìn)行比較，進(jìn)一步說明了國產(chǎn)試劑盒與國際進(jìn)口標(biāo)準(zhǔn)試劑盒診斷效果相當(dāng)，而以往研究[10]一般只選擇一種試劑盒與國產(chǎn)進(jìn)口試劑盒比較，本文的研究更具說服力。本文的研究局限在于只在國際標(biāo)準(zhǔn)試劑盒線性檢測(cè)范圍內(nèi)進(jìn)行比較， 該范圍較大，缺乏對(duì)低檢測(cè)區(qū)間范圍、中檢測(cè)區(qū)間及高檢測(cè)區(qū)間的相關(guān)性和一致性比較，此外缺乏20～1.7×108IU/mL 內(nèi)的比較。 后續(xù)課題組將繼續(xù)細(xì)化研究，利用已知濃度的國際標(biāo)準(zhǔn)品作為校正品，對(duì)比分析國內(nèi)不同廠家HBV DNA 定量試劑盒內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)品間存在的實(shí)測(cè)值與理論靶值的濃度差異、穩(wěn)定性差異及其相關(guān)性，為國內(nèi)HBV DNA 定量檢測(cè)試劑盒所使用的標(biāo)準(zhǔn)品的制備及使用建立更加規(guī)范統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，使HBV DNA 檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確、可靠，從而減少實(shí)驗(yàn)室間檢測(cè)差異帶來的醫(yī)患糾紛。

綜上所述，上述3 種不同國產(chǎn)的HBV DNA 檢測(cè)試劑盒準(zhǔn)確性良好，與國際標(biāo)準(zhǔn)品HBV DNA 檢測(cè)試劑盒在檢測(cè)區(qū)間20～1.7×108IU/mL 內(nèi)均具有較好的相關(guān)性和一致性，但仍需細(xì)化研究，以期提高國產(chǎn)試劑質(zhì)量。