鐘東玲 盧小燕 蔡丹燕 邱姍姍

（茂名市食品藥品檢驗(yàn)所 廣東茂名 525000）

1 前言

久芝清心丸收載于衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)（中藥成方制劑第七冊(cè)第九頁(yè)）[1]，具有瀉火、清熱、通便的作用。本品中的黃芩有清熱燥濕、止血、瀉火解毒、安胎等功效[2，3]。 現(xiàn)行久芝清心丸的部頒標(biāo)準(zhǔn)較為簡(jiǎn)單，僅提供顯微鑒別和冰片、大黃的薄層色譜鑒別。為了保證藥品的安全有效，對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行更深層次的研究，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)本藥品中黃芩的有效成分黃芩苷的含量進(jìn)行測(cè)定。

2 材料和儀器

材料：供試品久芝清心丸（批號(hào)1014847、1014840、1014844）；對(duì)照品黃芩苷（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110715-201318，含量93.3%）；甲醇（色譜純）；磷酸（分析純）；蒸餾水。

儀器：LC-2010CHT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；XS205 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司），KQ-300VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆明市超聲儀器有限公司）。

3 方法與結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱：RP-18 endcapped（5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：277 nm；柱溫：30℃；泵壓不大于25 MPa；定量方法：外標(biāo)法；進(jìn)樣量：10 μL。在此條件下，理論板數(shù)按黃芩苷計(jì)算不少于2 000，分離度大于1.5，詳見(jiàn)圖1～圖3。

圖1 黃芩苷對(duì)照品的液相色譜圖

圖2 久芝清心丸供試品的液相色譜圖

由圖1、圖2 和圖3 可知，供試品和對(duì)照品溶液在相同的保留時(shí)間處出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的峰，并且能達(dá)到基線分離；黃芩陰性對(duì)照品溶液在對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)吸收峰，表明其他味藥對(duì)黃芩苷的測(cè)定無(wú)干擾，該方法專屬性較好。

3.2 供試品溶液的制備

取大蜜丸適量，剪碎，混合均勻，精密稱定0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入50 mL 70%乙醇，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率50 kHz）30 min，取出，放冷，再精密稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 mL 置于25 mL 量瓶中，加70%乙醇稀釋到刻度，搖勻，用微孔濾膜濾過(guò)，即得。

3.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201318）10.46 mg（含量為93.3%），置于100 mL 容量瓶中，加入甲醇至容量瓶刻度，搖勻，即制得含量為97.59μg/mL的黃芩苷對(duì)照品貯備液，精密量取貯備液2 mL 置于10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（每1 mL中含黃芩苷19.52 μg）溶液。

3.4 陰性樣品溶液的制備

按久芝清心丸中處方比例，取除了黃芩外的其他10 味藥材，用打粉機(jī)粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩，充分混合均勻，再按3.3 項(xiàng)下提供的方法制成陰性溶液。

3.5 線性關(guān)系考察

圖3 黃芩陰性對(duì)照品的液相色譜圖

精密量取黃芩苷對(duì)照品貯備液97.59 μg/mL，按照0、1、5、10、20、50 倍的比例[4]分別稀釋成一系列不同濃度的對(duì)照品溶液，充分搖勻，即制得6 個(gè)不同濃度（0.097 59、0.048 80、0.019 52、0.009 76、0.004 88、0.001 95 μg/μL）的對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行測(cè)定，并以對(duì)照品的濃度（μg/μL）為縱坐標(biāo)，測(cè)得的峰面積為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸處理。

以黃芩苷對(duì)照品測(cè)得的峰面積值（y）作為縱坐標(biāo)，黃芩苷對(duì)照品的濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=37574x-22687，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9（n=6）。 結(jié)果表明，黃芩苷的進(jìn)樣量控制在0.001 95～0.097 59 μg 內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，說(shuō)明符合外標(biāo)法定量測(cè)定的要求。

3.6 儀器精密度試驗(yàn)

取相同濃度（0.019 52 mg/mL）的對(duì)照品溶液，按照擬定的色譜條件連續(xù)進(jìn)行進(jìn)樣6 次，進(jìn)而測(cè)定并記錄黃芩苷的峰面積。 根據(jù)藥典含量測(cè)定方法學(xué)驗(yàn)證中的精密度試驗(yàn)，規(guī)定相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不得大于3%[5]，實(shí)際測(cè)得結(jié)果的RSD=0.76%（n=6），結(jié)果顯示其精密度良好。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取6 份同一批號(hào)的供試品溶液，在相同色譜條件下測(cè)定，結(jié)果顯示黃芩苷的平均含量為7.825 6 mg/g，且在7.7850～7.879 0 mg/g 內(nèi)，其RSD=0.53%，表明相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較小有良好的重復(fù)性。

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在相同的色譜條件下，對(duì)同一供試品在不同時(shí)間段進(jìn)行含量測(cè)定，即0、2、4、8、12、16 h 分別開(kāi)始進(jìn)樣，結(jié)果表明含量的RSD=1.16%（n=6），表明在16 h 內(nèi)供試品溶液中黃芩苷的含量能基本維持穩(wěn)定。

3.9 加樣回收率試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)所建立的含量測(cè)定方法對(duì)供試品溶液的含量測(cè)定是否有影響，取同一批號(hào)相同濃度的供試品溶液進(jìn)行6 次回收率試驗(yàn)。 對(duì)照品加入量中的黃芩苷的含量和樣品中的黃芩苷的含量之和在規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍之內(nèi)，結(jié)果顯示6 次同一供試品溶液中測(cè)得的黃芩苷含量的平均回收率為99.88%，RSD=0.76%，測(cè)得結(jié)果在規(guī)定的平均回收率95%～105%內(nèi)，表明該方法切實(shí)可行，詳見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

3.10 樣品含量測(cè)定

取3 個(gè)批號(hào)的樣品（1014847，1014840，1014844），按擬定的色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果表明3 個(gè)批號(hào)的久芝清心丸中黃芩苷的含量略有不同，但是其RSD 都較小，表明該方法穩(wěn)定可行，詳見(jiàn)表2。

表2 久芝清心丸含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

4.1 提取方法的選擇

分別嘗試用70%乙醇加熱回流提取、70%乙醇超聲提取，結(jié)果表明本品用70%乙醇超聲提取方法簡(jiǎn)便且提取完全。

4.2 流動(dòng)相的選擇

參考《中國(guó)藥典》2010 年版一部黃芩藥材中的黃芩苷含量測(cè)定采用的流動(dòng)相比例為甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2），后來(lái)調(diào)整流動(dòng)相比例為甲醇-水-磷酸（45∶55∶0.2），發(fā)現(xiàn)其保留時(shí)間較長(zhǎng)，而且黃芩苷的液相色譜峰形較差，拖尾因子大，因此改用甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）為流動(dòng)相，更適合測(cè)定久芝清心丸中黃芩苷的含量，拖尾因子小，檢測(cè)目標(biāo)峰可達(dá)到基線分離。

5 結(jié)論

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，采用RP-18 endcapped（5 μm）為色譜柱，甲醇-水-磷酸（47∶53∶0.2）為流動(dòng)相，用277 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)測(cè)定久芝清心丸中黃芩苷的含量，黃芩苷濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。而且其穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度試驗(yàn)也呈現(xiàn)良好結(jié)果，黃芩苷液相色譜的峰與鄰峰的分離效果較好，且提取供試品方法僅為超聲提取，方法快捷簡(jiǎn)便，表明該方法可以在日后的生產(chǎn)及流通過(guò)程中控制久芝清心丸的質(zhì)量并提供參考價(jià)值。