張培哲，沈 滟，李 舍，駱 延，龔平原

原發(fā)性高血壓是遺傳與環(huán)境因素相互作用所致的復(fù)雜性疾病，臨床上認(rèn)為鹽離子和肥胖作為重要的環(huán)境和機(jī)體因素與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)[1]?；颊咄ǔ４嬖诩t細(xì)胞膜的鈉泵活性降低，鈉、鉀、氯等離子的協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)功能異常以及肥胖等特征[2]。腎素—血管緊張素系統(tǒng)對(duì)維持血管張力及水鈉平衡起了重要的調(diào)節(jié)作用[3]，交感神經(jīng)系統(tǒng)參與腎臟血流的調(diào)節(jié)。有研究表明α-2BAR基因12Glu9位點(diǎn)與自主神經(jīng)的緊張性有一定的相關(guān)性，其表達(dá)產(chǎn)物能影響血管內(nèi)皮對(duì)縮血管物質(zhì)的反應(yīng)性，從而影響外周微、小動(dòng)脈內(nèi)皮舒張功能，引起血壓變化[4]。多巴胺β羥化酶可將多巴胺(dopamine，DA)轉(zhuǎn)化為去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)，是兒茶酚胺類遞質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶之一，大量的證據(jù)表明，DBH 結(jié)構(gòu)基因特性決定血漿多巴胺β羥化酶的活性[5-6]，從而通過影響DA和NE的合成調(diào)控心血管功能。α-2BAR基因和DBH基因與原發(fā)性高血壓的關(guān)系日益受到人們的重視。目前雖有研究發(fā)現(xiàn)α-2BAR基因的12Glu9位點(diǎn)和DBH基因啟動(dòng)子區(qū)的19 bp Insert/Delet位點(diǎn)與原發(fā)性高血壓可能相關(guān)，但α-2BAR基因12Glu9位點(diǎn)和DBH基因的19 bp Insert/Delet位點(diǎn)與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性還有待進(jìn)一步證實(shí)。本研究通過對(duì)洛陽地區(qū)漢族人群中α-2BAR基因的12Glu9位點(diǎn)和DBH基因的19bp Insert/Delet位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，探討α-2BAR基因和DBH基因與原發(fā)性高血壓和有關(guān)離子濃度變化的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選擇在洛陽市第八人民醫(yī)院門診就診的、初診為原發(fā)性高血壓患者196例(病例組)，男103例，女93例，平均年齡(58.381±11.919)歲。符合WHO/ISH的診斷標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)體格檢查及實(shí)驗(yàn)室檢查，未經(jīng)降壓治療，每日鹽攝入量>6 g，排除繼發(fā)性高血壓、嚴(yán)重肝腎功能異常。選擇同期健康體檢者121例(對(duì)照組)，男63例，女58例，平均年齡(53.525±18.018)歲。近2個(gè)月內(nèi)未服藥，且每天鹽攝入量<6 g。入選者均知情并同意。

1.2方法

1.2.1樣品采集與基因組DNA提取 每日上午8：00～9：00在空腹情況下測(cè)量血壓，收縮壓和舒張壓均取3次測(cè)量平均值。然后采集靜脈血5 mL，其中3 mL用于鹽離子濃度測(cè)量，另外2 mL采用碘化鉀法提取外周血基因組DNA[7]。

1.2.2功能性多態(tài)位點(diǎn)的選擇 選取了α-2BAR基因和DBH基因最受關(guān)注的兩個(gè)功能性多態(tài)位點(diǎn)。其中19 bp Insert/Delet位點(diǎn)是DBH基因啟動(dòng)子區(qū)的一個(gè)插入缺失序列。

1.2.3功能性多態(tài)位點(diǎn)的基因分型 用Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物的序列參照NCBI提供的DNA序列信息。α-2BAR基因12Glu9位點(diǎn)上游引物的序列為5’-AGGGTGTTTGTGGGGCATCTCC-3’，下游引物的序列為5’-CAAGCTGAGGCCGGAGACACTG-3’； DBH基因19bp Insert/Delet位點(diǎn)上游引物的序列為5’-GCAAAAGTCAGGCACATGCACC-3’，下游引物的序列為5’-GTCAGCGAGATGGGGAGGTGGA-3’, 兩位點(diǎn)的PCR反應(yīng)體系包含雙組分簡(jiǎn)單型PCR反應(yīng)系統(tǒng)(Golden Easy PCR System，TIANGEN)4.5 μL，模版0.5 μL，ddH20 4.5 μL，引物各0.25 μL。α-2BAR基因位點(diǎn)的PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，69℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次，最后72℃延伸4 min；DBH基因位點(diǎn)的PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，67.5℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次，最后72℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物4 μL，經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠恒壓電泳200 V×3 h后，0.1%硝酸銀染色、顯色判別基因型；最后隨機(jī)取代表不同的分型結(jié)果的PCR產(chǎn)物各3份進(jìn)行測(cè)序，進(jìn)一步明確各分型結(jié)果所代表的具體堿基。

1.2.4統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 10.0進(jìn)行部分?jǐn)?shù)據(jù)的處理，使用Fittine軟件進(jìn)行Hard-Weinberg平衡檢驗(yàn)，使用CLUMP2.3軟件對(duì)基因型頻率和等位基因頻率在病例組與對(duì)照組之間進(jìn)行比較，使用單因素方差分析法分析基因型與收縮壓、舒張壓等臨床指標(biāo)之間的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1兩組相關(guān)資料比較病例組個(gè)體的體質(zhì)量指數(shù)較對(duì)照組明顯偏高，兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)病例組的Na+濃度較對(duì)照組也有顯著差異，而K+濃度、Cl-濃度無顯著差異(表1)。

表1 病例組和對(duì)照組之間相關(guān)臨床指標(biāo)的比較

2.2基因分型結(jié)果及哈德-溫伯格平衡檢驗(yàn)通過分型并結(jié)合測(cè)序，檢測(cè)到α-2BAR基因12Glu9位點(diǎn)具有3種基因型，Glu9/Glu9基因型體84人、Glu9/Glu12基因型167人、Glu12/Glu12基因型58人；檢測(cè)到DBH基因19 bp Insert/Delet位點(diǎn)的各基因型頻數(shù)為：Insert/ Insert基因型72人、Insert/Delet基因型155人、Delet/Delet基因型55人。α-2BAR基因12Glu9位點(diǎn)和DBH基因19 bp Insert/Delet位點(diǎn)在該人群樣本中均符合哈德-溫伯格平衡(P=0.119，F(xiàn)=0.089；P=0.083，F(xiàn)=0.103)。

2.312Glu9位點(diǎn)和19bpInsert/Delet位點(diǎn)與原發(fā)性高血壓的關(guān)系分析α-2BAR基因的基因型頻率、等位基因頻率在病例組和對(duì)照組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.158，P=0.876),DBH基因的基因型頻率、等位基因頻率在病例組和對(duì)照組之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P=0.322，P=0.442) (表2)。

表2 基因型及等位基因頻率在病例組和對(duì)照組中的比較

2.4兩基因與有關(guān)臨床指標(biāo)的關(guān)系分析使用單因素方差分析基因型與收縮壓、舒張壓等臨床指標(biāo)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示各基因型之間收縮壓、舒張壓、體質(zhì)量指數(shù)、Na+濃度、K+濃度、 Cl-濃度均無顯著性差異(表3)。

表3 α-2B AR基因和DBH基因位點(diǎn)基因型和各臨床特征之間的關(guān)系

3 討論

α-2BAR基因和DBH基因在腎素—血管緊張素系統(tǒng)中起重要的作用。已有研究發(fā)現(xiàn)α-2BAR基因中谷氨酸重復(fù)的3個(gè)缺失與小動(dòng)脈順應(yīng)性和人類的肥胖有密切關(guān)系[4,8-9]，另外Ueno等的研究發(fā)現(xiàn)α-2BAR基因與自主神經(jīng)系統(tǒng)的功能有關(guān)[10]，其中α-2BAR基因的12Glu9位點(diǎn)多態(tài)性通過影響自主神經(jīng)系統(tǒng)功能導(dǎo)致代謝紊亂[10-11]，在向心性肥胖者中Glu9/Glu9個(gè)體的自主神經(jīng)緊張性明顯受抑制[12]，但通過本實(shí)驗(yàn)得出α-2BAR基因 12Glu9位點(diǎn)在本人群中與原發(fā)性高血壓無顯著相關(guān)性。關(guān)于該基因與人類心腦血管病的報(bào)道多來自歐美國家人群，尚未見來自國內(nèi)的相關(guān)報(bào)道。本研究首次在中國漢族人群中開展了α-2BAR基因與高血壓的關(guān)系研究，但由于本實(shí)驗(yàn)的樣本量較小以及選樣的區(qū)域性等因素的影響，未發(fā)現(xiàn)α-2BAR基因?qū)Ω哐獕河酗@著影響。

DBH基因19 bp Insert/Delet位點(diǎn)的多態(tài)性與多巴胺β羥化酶活性有一定的相關(guān)性。多巴胺β羥化酶將DA羥化為NE，是DA轉(zhuǎn)化為NE的關(guān)鍵酶之一，其活性影響NE的合成，NE對(duì)心血管功能調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛和情感障礙起重要作用。已有研究表明DA可以調(diào)控心血管功能，進(jìn)而影響NE的升壓作用[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)DBH基因19 bp Insert/Delet位點(diǎn)與原發(fā)性高血壓無顯著相關(guān)性。有關(guān)該基因的相關(guān)報(bào)道大多為其中樞神經(jīng)作用，有關(guān)心血管的作用還不明確。本實(shí)驗(yàn)通過研究其與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性來闡述其影響，具有一定的參考價(jià)值，但本實(shí)驗(yàn)的人群具有地區(qū)局限性，所選取的樣本量也有待進(jìn)一步提高，該基因與原發(fā)性高血壓的相關(guān)性是否存在地區(qū)差異性也有待進(jìn)一步探討。

參考文獻(xiàn)：

[1] Blaustein MP，Zhang J，Chen I，et al.How does salt retention raise blood pressure[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2006，290(3)：514-523.

[2] Morrison RG，Mills C，Moran AL，et al. A moderately high fat diet promotes salt-sensitive hypertension in obese zucker rats by impairing nitric oxide production[J].Clin Exp Hypertens，2007，29(6)：369-381.

[3] Junemaitre X，Inoue I，Willians C，et al.Haplotype of angiotensinogenin essential hypertension[J].Am J Hum Genet，1997，60(6)：1448-1460.

[4] 李新立，梁立榮，倪春輝，等.α-2B腎上腺素能受體基因 I/D多態(tài)性與小動(dòng)脈順應(yīng)性的關(guān)系[J].中華心血管病雜志，2006，34(3)： 249-251.

[5] 龔平原，張科進(jìn)，高曉彩，等.中央執(zhí)行功能與單胺氧化酶A、多巴胺β羥化酶基因功能多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究[J].中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2011，20(4)：289-291.

[6] 趙曉萍，謝惠君，湯國梅，等.多巴胺β 羥化酶基因多態(tài)性與帕金森病遺傳易感性[J].中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2003，20(3)：238-240.

[7] 趙書平，張俊潔，尤建，等.一種碘化鉀提取外周血基因組DNA的方法[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志，1999，16(6)：395-396.

[8] Cubells JF，van kammen DP，Kelley ME，et al.Dopamine beta-hydroxylase: two polymorphisms in linkage disequilibrium at the structural gene DBH associate with biochemical phenotypic variation[J].Hum Genet, 1989, 102(5)：533-540.

[9] Katariina S， Leo N， Markku L，et al.A Deletion in the α2B-Adrenergic receptor gene and autonomic nervous function in central obesity[J].Obes Re，2003，11(8)：962-970.

[10] Ueno LM，F(xiàn)razzatto ES，Batalha LT，et al.alpha2B-Adrenergic receptor deletion polymorphism and cardiac autonomic nervous system responses to exercise in obese women [J].Intl J Obes，2006，30(2)：214-220.

[11] Suzuki N，Matsunaga T，Nagasumi K，et al.Alpha(2B)-adrenergic receptor deletion polymorphism associates with autonomic nervous system activity in young healthy Japanese[J].J Clin Endocrinol Metab，2003，88(3)：1184-1187.

[12] Sivenius K，Niskanen L，Laakso M，et al.A deletion in the alpha 2B-adrenergic receptor gene and autonomic nervous function in central obesity [J].Obes Res，2003，11(8)：962-970.

[13] Abe M，Wu Z，Yamamoto M，et al.Association of dopamine beta-hydroxylase polymorphism with hypertension through interaction with fasting plasma glucose in Japanese[J].Hypertension Res，2005，28(3)：215-221.

[14] 潘棱，沈曉麗，林立芳，等.對(duì)原發(fā)性高血壓患者血漿兒茶酚胺的探討[J].華西醫(yī)學(xué)，1998 ，13( 4)：430-431.