朱巧玲，冷佳奕，葉慶生

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510631)

石斛屬(Dendrobium)是蘭科中最大的屬之一，已被列入《瀕危野生動(dòng)植物種國(guó)際貿(mào)易公約》(CITES)附錄中，全球約有1 500～1 600 種，是全球最具觀賞價(jià)值的四大蘭花之一. 我國(guó)特有的野生石斛都是春天開花的春石斛. 對(duì)金釵石斛、霍山石斛、鐵皮石斛等的光合作用、生長(zhǎng)和栽培做過(guò)一些研究［1－4］，但對(duì)野生石斛的光合特性的研究缺乏系統(tǒng)性的研究.蘭科植物根據(jù)葉片的厚薄將蘭花分為厚葉蘭和薄葉蘭.一般認(rèn)為，厚葉蘭屬CAM 植物，如蝴蝶蘭;薄葉蘭屬C3植物，如蘭屬植物，蘭科植物還未發(fā)現(xiàn)有C4類型［5－10］. 我國(guó)的野生石斛有70 多個(gè)種，分9個(gè)組［11］，其中大花石斛組(Sect. Eugenaanthe)最為豐富，占已有種的50%以上，有很好的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值.但關(guān)于我國(guó)野生石斛的光合途徑尚未有統(tǒng)一的定論.本文以大花石斛組的束花石斛和黃花石斛為材料，對(duì)它們的光合特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究，為石斛屬植物的資源保護(hù)和利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料石斛采集自云南高黎貢山的野生種:大花組的束花石斛(D.chrysanthum)和黃花石斛(D.dixanthum)，用樹皮盆栽于遮陽(yáng)率小于50%的塑料溫室大棚中，白天(30±2)℃，夜間(25±3)℃，濕度65～90%，每星期施用1 次3 倍稀釋的Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液.所有實(shí)驗(yàn)測(cè)定均選取頂部向下的第4 片成熟葉片，3個(gè)重復(fù).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 葉片顯微結(jié)構(gòu)觀察 葉片解剖結(jié)構(gòu)采用光學(xué)顯微鏡觀察和掃描顯微鏡觀察.

1.2.2 葉綠素含量的測(cè)定 按WINTERMANS ＆DE MOTS［12］方法測(cè)定.

1.2.3 RuBPCase( EC 4.1.1.39) 、PEPCase( EC 4.1.1.31) 、GO( EC 1.1.3.1) 酶液提取和活性的測(cè)定 2 種石斛植株葉片各0.2 g 放入預(yù)冷的研缽中，加入1.5 mL 預(yù)冷的100 mmol /L Tris－ HCL 緩沖液(含10 mmol /L MgCl2、5 mmol/L 巰基乙醇，1 mmol/L EDTA，12.5% 甘油和1% 聚乙烯吡咯烷酮，pH 7.4)，迅速研磨，勻漿經(jīng)4 層紗布過(guò)濾后4 ℃下15 000 r/min 離心25 min，取上清液用于酶活性的測(cè)定.

RuBPCase、PEPCase 和GO 活性的測(cè)定按葉慶生［7］的方法測(cè)定.蛋白質(zhì)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定酶提取液中蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.4 光合特性測(cè)定 用便攜式光合測(cè)定儀LI－6400(Li－Cor，USA)，同時(shí)測(cè)定凈光合速率(Pn)、氣孔阻力(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)、有效光輻射(PAR)、大氣溫度(Tair)等各種指標(biāo)，3～9次重復(fù)，每次重復(fù)測(cè)定3～5 片，取平均值.

光響應(yīng)曲線:測(cè)量時(shí)間為晴天上午9:30—11:30，利用LI－6400 自動(dòng)光響應(yīng)曲線測(cè)定功能，將LI－6400 內(nèi)置紅藍(lán)光源(6400－02B)在0～1 200 μmol/(m2·s1)設(shè)定一系列PAR 梯度分別測(cè)定對(duì)應(yīng)梯度葉片Pn，將Pn和PAR 的成對(duì)值作出相應(yīng)曲線，得到LCP、LSP 等相關(guān)參數(shù);將200 μmol/(m2·s1)以內(nèi)的PAR 和Pn的成對(duì)值進(jìn)行直線回歸，求得Pn－PAR 響應(yīng)曲線的初始斜率即為光合作用的AQY.測(cè)定時(shí)CO2濃度設(shè)為(380 ±10)μmol/mol，葉片溫度:(25 ±0.5)℃，相對(duì)濕度為(70 ±15)%.

CO2響應(yīng)曲線:利用LI－6400 便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)的注入系統(tǒng)(6400－01)設(shè)定CO2濃度，控制PAR 在(800 ±10)μmol/(m2·s)，溫度為(25 ±0.5)℃，RH:(70 ±15)%，在0～1 500 μmol/mol 范圍內(nèi)設(shè)定CO2濃度梯度，分別測(cè)定Pn，將Pn和PAR的成對(duì)值作出相應(yīng)曲線，得到CCP、CSP 及相關(guān)參數(shù);將200 μmol/(m2·s)以內(nèi)的CO2濃度和Pn的對(duì)應(yīng)值進(jìn)行直線回歸，初始斜率即為RuBPCase 的CE.CO2光飽和點(diǎn)時(shí)的Pn為RuBP 再生速率.

溫度響應(yīng)曲線:用LI－6400 便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)的葉室調(diào)溫系統(tǒng)(6400－13)，在18～34 ℃溫度范圍內(nèi)，從低到高測(cè)定各溫度梯度的Pn值，測(cè)定時(shí)PAR 設(shè)為(800 ±10)μmol/(m2·s)，CO2濃度控制為(380 ±10)μmol/mol，相對(duì)濕度為(70 ±15)%左右.

凈光合速率Pn日變化和季節(jié)變化測(cè)定:日變化測(cè)定于5月中旬選擇3個(gè)晴天從7:00—19:00，每隔1 h 用LI－6400 便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定Pn等光合作用相關(guān)參數(shù);季節(jié)變化于3—10月每月中旬選擇3個(gè)晴天，于10:00—11:00 在自然條件下用LI－6400 便攜式光合測(cè)定系統(tǒng)測(cè)定Pn等光合作用相關(guān)參數(shù).

1.2.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)日變化的測(cè)定 于5—7月選擇3個(gè)晴天，用德國(guó)WALZ 公司生產(chǎn)的PAM2100葉綠素?zé)晒鈨x選取生長(zhǎng)健康，長(zhǎng)勢(shì)一致的石斛植株的功能葉片進(jìn)行測(cè)定，每種植株測(cè)定3～5 片葉，每片葉選取1個(gè)圓形區(qū)域(area of interest. AOI，直徑1 cm)進(jìn)行測(cè)定和統(tǒng)計(jì). 葉綠素?zé)晒鈪?shù)分別為:Fv/Fm(PS II 最大原初光能轉(zhuǎn)換效率);Yield (PS II實(shí)際光化學(xué)效率);Fo(初始熒光強(qiáng)度)等，各數(shù)值及其對(duì)應(yīng)的熒光圖像在飽和脈沖過(guò)程中被ImagingWin軟件實(shí)時(shí)記錄.

2 結(jié)果與討論

2.1 束花石斛、黃花石斛葉片的超微結(jié)構(gòu)

電鏡觀察發(fā)現(xiàn)束花石斛和黃花石斛葉肉組織內(nèi)的葉綠體內(nèi)淀粉顆粒等較多且大;葉片葉脈主脈發(fā)達(dá)，側(cè)脈細(xì)小. 橫切面上，葉脈維管束排列為圓環(huán)狀，葉脈的維管束鞘薄壁細(xì)胞較小，排列清晰，不含葉綠體，沒有花環(huán)型結(jié)構(gòu). 葉肉細(xì)胞中葉綠體數(shù)目較多.2 種石斛葉片解剖結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出C3植物特征(圖1A、B).

圖1 束花石斛、黃花石斛葉片下表面掃描電鏡圖(A、B)和葉片橫切面石蠟切片圖(C、D)Figure 1 Electron microscope images of the lower surface (A，B)and paraffin section of cross－section (C，D)of D.chrysanthum and D.dixanthum

束花石斛和黃花石斛葉片都為背腹型葉，厚度約為300～400 μm，相對(duì)于蝴蝶蘭等厚葉蘭(CAM植物，葉片厚度約為3 000 μm)屬于薄葉蘭類型.葉片上表面無(wú)氣孔分布，有角質(zhì)層，葉片上表面細(xì)胞比較整齊分布，都呈近長(zhǎng)方形排列.葉片下表面細(xì)胞均為不規(guī)則形狀，大小不等，氣孔分布于下表面(圖1C、D).2 種石斛葉片的氣孔密度比較高，大約達(dá)到97～123個(gè)/mm2，氣孔結(jié)構(gòu)為橢圓形，下陷，大小約為20～30 μm，上覆有蠟質(zhì)的氣孔蓋. 葉肉組織發(fā)達(dá)，分化為柵欄組織與海綿組織，但不是很明顯. 柵欄組織由1～2 層排列整齊的圓柱狀細(xì)胞構(gòu)成，厚約為60 μm，外層細(xì)胞排列緊密，染色較深，呈異細(xì)胞狀，內(nèi)層細(xì)胞染色較淺，含豐富的葉綠體;海綿組織細(xì)胞排列疏松，厚約40 μm 也含有較多的葉綠體.

2 種石斛葉片的氣孔密度較高，氣孔密度大，吸收CO2量多，有利于植物光合作用;有研究指出，氣孔密度、柵欄組織厚度與海綿厚度的比值與Pn值表現(xiàn)出一定的相關(guān)性［13－14］.石斛葉片表皮細(xì)胞排列緊密，葉肉柵欄組織發(fā)達(dá)，含有較多的葉綠體的結(jié)構(gòu)有利于它們?cè)谏质a蔽環(huán)境下的光合作用，是長(zhǎng)期自然適應(yīng)的結(jié)果.

2.2 束花石斛和黃花石斛光合速率(Pn)對(duì)光強(qiáng)、CO2 和溫度的響應(yīng)

束花石斛、黃花石斛葉片的Pn－PAR 曲線呈相似的變化趨勢(shì)(圖2).PAR 為0～300 μmol/(m2·s)內(nèi)，隨著PAR 的增強(qiáng)，Pn呈線性迅速增大，PAR 為300～800 μmol/(m2·s)時(shí)，Pn增加趨緩.當(dāng)PAR 為800 μmol/(m2·s)時(shí)，Pn達(dá)到最大，PAR 繼續(xù)增加，Pn則略有下降;2 種石斛蘭的最大光合速率(Pn)約6.0 μmol/(m2·s)左右，光補(bǔ)償點(diǎn)為5.0～8.0 μmol/(m2·s)，光飽和點(diǎn)在850～900 μmol/(m2·s)(表1).上述結(jié)果表明，石斛蘭的LSP 和LCP 相對(duì)低，具有陰生或半陰生植物的特點(diǎn)，這與其適于生長(zhǎng)在較蔭處的生活習(xí)性相適應(yīng). 表觀量子效率(AQY)是葉片光能利用效率的一個(gè)重要指標(biāo)，反映葉片對(duì)弱光的利用能力.2 種石斛蘭葉片的AQY 在0.022左右，表明束花石斛和黃花石斛的光能利用效率比較低，光合作用時(shí)對(duì)光量子要求較高，對(duì)弱光的利用潛能也比較大.

2 種石斛蘭的凈光合速率Pn對(duì)CO2濃度變化的響應(yīng)也基本相同(圖2，表1)，CO2補(bǔ)償點(diǎn)(CCP)在80.00～90.00 μmol/mol;CO2濃度在0～700 μmol/mol 范圍內(nèi)，隨著CO2濃度的升高，Pn快速增加;當(dāng)CO2濃度達(dá)到800 μmol/mol 左右時(shí)，Pn達(dá)到最大，約為8.0～10.0 μmol/(m2·s)，表明束花石斛、黃花石斛的CO2飽和點(diǎn)(CSP)在850～900 μmol/mol.2 種石斛蘭葉片的羧化效率分別為0.018 和0.022，即石斛蘭光合作用時(shí)每固定1個(gè)CO2分子需要的CO2分子數(shù)約為45～55，說(shuō)明它們的羧化效率低，增加CO2濃度可以顯著提高它們的光合速率.

圖2 束花石斛和黃花石斛的光強(qiáng)、CO2 濃度和溫度響應(yīng)曲線Figure 2 Response curves of light intensity，CO2 and temperature in the leaves of D.chrysanthum and D.dixanthum

表1 束花石斛和黃花石斛葉片的光響應(yīng)特性和CO2 響應(yīng)特性Table 1 Characteristics of light and CO2 responses of the leaves of D.chrysanthum and D.dixanthum

溫度是植物光合速率的主要影響因子. 束花石斛、黃花石斛的Pn在18～26 ℃范圍隨著溫度的升高而呈線性上升(圖2)，當(dāng)溫度在26 ℃左右時(shí)，最大Pn在5.0～6.0 μmol/(m2·s)，當(dāng)溫度超過(guò)30 ℃后，Pn隨著溫度的升高而下降. 這些結(jié)果表明石斛蘭的光合作用最適溫度約為26～30 ℃.這與霍山石斛、銅皮石斛的光合作用最適溫度在25～30 ℃的結(jié)果基本一致［15］.

2 種石斛蘭葉片的光飽和點(diǎn)到了最大日照強(qiáng)度(1 800～2 200 μmol/(m2·s1))的40%～50%，為半陰生植物特征.此外，2 種石斛葉片的羧化效率在0.02 左右，對(duì)低CO2濃度的利用率比較低.因此，增加CO2濃度可以提高它們的光合速率，有利于石斛蘭生長(zhǎng).溫度一方面通過(guò)影響Ci間接影響Pn，另一方面影響葉片內(nèi)光合作用相關(guān)酶的活性，每種植物的光合作用都有其能夠適應(yīng)的溫度范圍與最適宜的溫度范圍［16－17］.本研究的2 種石斛蘭光合作用最適溫度在26～30 ℃之間，這表明它們適合在熱帶亞熱帶地區(qū)生長(zhǎng).

2.3 束花石斛和黃花石斛葉片的光合速率日變化特征

束花石斛和黃花石斛的凈光合速率Pn日變化都具有相同的變化趨勢(shì)，呈雙峰曲線(圖3)，從7:00 開始，Pn呈快速線性上升趨勢(shì)，11:00 左右光合速率達(dá)到最大，它們最大凈光合速率Pn在5.0～6.0 μmol/(m2·s)，隨后下降，13:00—14:00 達(dá)到最低點(diǎn)，表現(xiàn)出明顯的“光合午休”現(xiàn)象. 這是因?yàn)?3:00—14:00，外界環(huán)境中的光強(qiáng)和溫度的不斷升高，超出2 種石斛光合作用的最高點(diǎn)，強(qiáng)光和高溫對(duì)植株的脅迫作用，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉或部分關(guān)閉從而引起了“光合午休”現(xiàn)象的發(fā)生.14:00 以后，植物的光合速率又有所上升，15:00 左右出現(xiàn)Pn的第2個(gè)峰，但光合速率比上午的第1個(gè)峰要低得多，以后Pn快速下降.此外，繼續(xù)的測(cè)定表明，2 種石斛在夜間都沒有CO2吸收，這些表明束花石斛和黃花石斛不是CAM 植物而應(yīng)該是C3光合途徑植物.

圖3 束花石斛和黃花石斛的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率日變化Figure 3 Diurnal variation of Pn，Gs and Tr in the leaves of D.chrysanthum and D.dixanthum

2 種石斛光合速率日變化的“午休”現(xiàn)象，是環(huán)境條件和葉片的生理因素相互作用的綜合結(jié)果. 從外界環(huán)境的光強(qiáng)和溫度日變化情況看(圖3)，在7:00—11:00，Pn的增加和PAR、溫度呈正相關(guān)，11:00 以后光強(qiáng)和溫度的繼續(xù)上升超過(guò)了光合作用的最適條件，使得氣孔孔縮小或部分關(guān)閉從而使得氣孔阻力(Gs)增大、蒸騰速率(Tr)下降(圖3)，導(dǎo)致Pn下降，從而出現(xiàn)了“光合午休”現(xiàn)象.此現(xiàn)象實(shí)際上是植物的一種光保護(hù)機(jī)制，避免中午因過(guò)高的光強(qiáng)和溫度對(duì)植株光合機(jī)構(gòu)遭到破壞.2 種石斛的光合作用日變化特點(diǎn)與蘭屬植物的研究結(jié)果也是基本相似的［7－8］.

2.4 束花石斛、黃花石斛葉綠素?zé)晒庀嚓P(guān)參數(shù)日變化

2 種石斛葉片的Fv/Fm日變化趨勢(shì)相似，全天基本呈“V”型(圖4). 早上7:00—11:00 隨著光照強(qiáng)度和氣溫的增加，F(xiàn)v/Fm逐漸下降，在13:00 下降到一天中的最小值.之后隨著光強(qiáng)和溫度的逐漸降低，F(xiàn)v/Fm值迅速回升.這表明石斛蘭光合作用的器官在中午光強(qiáng)和溫度較高下其光合活性受到了暫時(shí)的抑制，但光合器官并沒有受到損傷.

2 種石斛的Fo的日變化趨勢(shì)也基本一致，全天呈波動(dòng)下降狀態(tài)(圖4).從早上7:00 開始，F(xiàn)o均呈緩慢下降趨勢(shì)，大約都在13:00 左右達(dá)到最低值，表明此時(shí)熱耗散增加［18－21］，但束花石斛15:00 左右又有一小的上升波峰，之后又趨于下降.這些結(jié)果均表明，2 種石斛葉片都可以通過(guò)增強(qiáng)非輻射能量耗散來(lái)消耗過(guò)剩的光能，從而使光合機(jī)構(gòu)免受破壞.

束花石斛、黃花石斛的Yield日變化在中午13:00 左右出現(xiàn)一低谷，之后又逐漸上升(圖4).Yield日變化幅度在0.35～0.65 之間變動(dòng).

葉綠素?zé)晒鈪?shù)可以反映光合機(jī)構(gòu)內(nèi)部一系列重要的調(diào)節(jié)過(guò)程. Fv/Fm的降低是判斷植物受光抑制的重要標(biāo)準(zhǔn)［19－22］，2 種石斛的Fv/Fm值變化呈“V”型，表明它們光合作用的器官的光合活性受到了暫時(shí)的抑制，但未受到損傷. Fo的日變化表明它們都可以通過(guò)增強(qiáng)非輻射能量耗散來(lái)消耗過(guò)剩的光能，從而使光合機(jī)構(gòu)免受破壞.

2.5 束花石斛、黃花石斛葉綠素含量和光合關(guān)鍵酶活性的變化

束花石斛、黃花石斛葉片總Chl 含量約為1.50 mg/g 左右，Chl(a/b)的比值在2.50～2.60 之間變化(表2).HOLDEN［23］廣泛地比較了C3植物和C4植物的葉綠素a/b 值，結(jié)果認(rèn)為，C4植物比C3植物具有較高的葉綠素a/b 值，特別是在單子葉植物中，差別更為明顯，因?yàn)樵趩巫尤~C4植物維管束鞘細(xì)胞中葉綠體的葉綠素a/b 值比葉肉細(xì)胞高. C4植物甘蔗葉片的葉綠素a/b 值高達(dá)4 以上.石斛屬也是單子葉植物，2 種石斛葉片表現(xiàn)出典型的C3植物葉綠素Chl(a/b)比值特點(diǎn).

圖4 束花石斛和黃花石斛葉綠素?zé)晒庀嚓P(guān)參數(shù)日變化Figure 4 The daily curve of chlorophyll fluorescence parameters in D.chrysanthum and D.dixanthum

表2 束花石斛和黃花石斛葉綠素含量的變化Table 2 The chlorophyll content and ratio of leaves of D.chrysanthum and D.dixanthum

酶活性的測(cè)定結(jié)果表明(表3)，2 種石斛蘭的PEPCase 活性非常低，分別為1. 17 和1. 21 nmol/(mg·min). PEPCase 是C4和CAM 植物的主要標(biāo)志酶之一，在C4植物甘蔗葉片中活性高達(dá)100 nmol/(mg·min)以上，而在C3植物中PEPCase 活性極低.這一研究結(jié)果與EDWARDS 等［24］的結(jié)果以及作者測(cè)定蘭屬植物的結(jié)果也是一致的［7－8］，說(shuō)明2 種石斛應(yīng)該是C3光合途徑植物，不太可能是C4和CAM 植物. 而它們都具有較高的RuBPCase 和GO 活性，說(shuō)明它們是典型的C3光合途徑植物，且具有較高的光呼吸.

表3 束花石斛和黃花石斛葉片光合關(guān)鍵酶活性Table 3 The activities of key emzymes of phtotosynthesis in leaves of D.chrysanthum and D.dixanthum

2.6 束花石斛、黃花石斛光合速率的年變化

束花石斛、黃花石斛葉片的光合作用Pn季節(jié)變化規(guī)律比較相似(圖5)，呈單峰曲線，3月以后，Pn逐漸增加，6—7月Pn達(dá)到最高，9月以后緩慢下降，11月以后下降較快.2 種石斛在6—7月光合作用最強(qiáng)，這可能與這個(gè)季節(jié)環(huán)境溫度和光強(qiáng)都較為適合石斛的光合作用以及葉片的生長(zhǎng)成熟等等因素有關(guān).1—2月和11—12月Pn值比較低，可能是因此段時(shí)間環(huán)境溫度、光強(qiáng)較低，且石斛蘭葉片尚在發(fā)育過(guò)程中，造成光合強(qiáng)度較低表現(xiàn)為Pn較低. 石斛蘭Pn季節(jié)變化總之5—8月是石斛蘭生長(zhǎng)發(fā)育旺盛期.

圖5 束花石斛和黃花石斛凈光合速率年變化Figure 5 Pn Annual change of D. chrysanthum and D. dixanthum

總之，對(duì)束花石斛和黃花石斛葉片的結(jié)構(gòu)、光合特性、標(biāo)志性酶活性等的研究結(jié)果表明:兩者屬于典型的C3植物.

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