鄭 瑞，周方方，林 萍，姚小華，陸 暢，張小平，①

(1.安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，安徽蕪湖241000;2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江富陽(yáng)311400)

油茶(Camellia oleifera Abel)又名茶子樹(shù)、茶油樹(shù)、百花茶，為山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia Linn.)多年生常綠小喬木，是中國(guó)特有的食用油料樹(shù)種，系世界四大木本油料樹(shù)種之一。茶油以單不飽和脂肪酸為主要成分，且富含VA和VE等，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，素有“液體黃金”的美譽(yù)。近年來(lái)中國(guó)油茶種植業(yè)發(fā)展迅速，油茶種植面積迅速增加［1］。

油茶是中國(guó)南方最重要的木本食用油料樹(shù)種，分布廣、面積大，但產(chǎn)量低且不穩(wěn)定。因此，培育高產(chǎn)、性能穩(wěn)定的油茶新品種非常重要［2］。雜交育種是油茶育種的重要手段，但前提是必須對(duì)目前眾多的油茶品種進(jìn)行分類(lèi)。

葉片作為植物的重要器官之一，其解剖學(xué)特征可作為種間或種下類(lèi)群的分類(lèi)依據(jù)。為此，作者采用石蠟切片法，從植物解剖學(xué)角度研究并探討不同油茶品種葉片及其中脈橫切面解剖結(jié)構(gòu)的異同，分析其相關(guān)性和差異性，并在此基礎(chǔ)上對(duì)供試的61個(gè)油茶品種進(jìn)行比較與歸類(lèi)，以期為油茶品種分類(lèi)提供形態(tài)解剖學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試61個(gè)油茶品種全部于2009年11月取自浙江富陽(yáng)油茶基地(浙江東方紅林場(chǎng))，包括紅花油茶系列(Honghuayoucha series)的6個(gè)品種‘dy46’、‘fy7’、‘hy114’、‘dy156’、‘hy1’和‘hy17’;長(zhǎng)林系列(Changlin series)的 43個(gè)品種‘長(zhǎng)林 27號(hào)’(‘Changlin 27’)、‘長(zhǎng)林 21 號(hào)’(‘Changlin 21’)、‘長(zhǎng)林91號(hào)’(‘Changlin 91’)、‘長(zhǎng)林185號(hào)’(‘Changlin 185’)、‘長(zhǎng)林 219 號(hào)’(‘Changlin 219’)、‘長(zhǎng)林 15號(hào)’(‘Changlin 15’)、‘長(zhǎng)林81號(hào)’(‘Changlin 81’)、‘長(zhǎng)林 90 號(hào)’(‘Changlin 90’)、‘長(zhǎng)林 94 號(hào)’(‘Changlin 94’)、‘長(zhǎng)林 145 號(hào)’(‘Changlin 145’)、‘長(zhǎng)林 152號(hào)’(‘Changlin 152’)、‘長(zhǎng)林 20號(hào)’(‘Changlin 20’)、‘長(zhǎng)林 29 號(hào)’(‘Changlin 29’)、‘長(zhǎng)林31號(hào)’(‘Changlin 31’)、‘長(zhǎng)林 40號(hào)’(‘Changlin 40’)、‘長(zhǎng)林 46 號(hào)’(‘Changlin 46’)、‘長(zhǎng)林 52 號(hào)’(‘Changlin 52’)、‘長(zhǎng)林54 號(hào)’(‘Changlin 54’)、‘長(zhǎng)林56號(hào)’(‘Changlin 56’)、‘長(zhǎng)林 65號(hào)’(‘Changlin 65’)、‘長(zhǎng)林 67 號(hào)’(‘Changlin 67’)、‘長(zhǎng)林 72 號(hào)’(‘Changlin 72’)、‘長(zhǎng)林82 號(hào)’(‘Changlin 82’)、‘長(zhǎng)林87號(hào)’(‘Changlin 87’)、‘長(zhǎng)林 88號(hào)’(‘Changlin 88’)、‘長(zhǎng)林 89 號(hào)’(‘Changlin 89’)、‘長(zhǎng)林 95 號(hào)’(‘Changlin 95’)、‘長(zhǎng)林96 號(hào)’(‘Changlin 96’)、‘長(zhǎng)林97號(hào)’(‘Changlin 97’)、‘長(zhǎng)林 98號(hào)’(‘Changlin 98’)、‘長(zhǎng)林99號(hào)’(‘Changlin 99’)、‘長(zhǎng)林 100 號(hào)’(‘Changlin 100’)、‘長(zhǎng)林101 號(hào)’(‘Changlin 101’)、‘長(zhǎng)林 102 號(hào)’(‘Changlin 102’)、‘長(zhǎng)林 106 號(hào)’(‘Changlin 106’)、‘長(zhǎng)林119 號(hào)’(‘Changlin 119’)、‘長(zhǎng)林 151 號(hào)’(‘Changlin 151’)、‘長(zhǎng)林 153 號(hào)’(‘Changlin 153’)、‘長(zhǎng)林155 號(hào)’(‘Changlin 155’)、‘長(zhǎng)林 161 號(hào)’(‘Changlin 161’)、‘長(zhǎng)林 162 號(hào)’(‘Changlin 162’)、‘長(zhǎng)林 182 號(hào)’(‘Changlin 182’)和‘長(zhǎng)林 214號(hào)’(‘Changlin 214’);湘林系列(Xianglin series)品種‘湘 5’(‘Xiang 5’);閩優(yōu)系列(Minyou series)的5個(gè)品種‘閩優(yōu)2’(‘Minyou 2’)、‘閩優(yōu)6’(‘Minyou 6’)、‘閩優(yōu) 10’(‘Minyou 10’)、‘閩優(yōu) 11’(‘Minyou 11’)和‘閩優(yōu) 43’(‘Minyou 43’);桐系列(Tong series)品種‘桐11’(‘Tong 11’);贛系列(Gan series)品種‘贛1’(‘Gan 1’);桂無(wú)系列(Guiwu series)品種‘桂3’(‘Gui 3’)和‘桂4’(‘Gui 4’);亞家系列(Yajia series)品種‘亞家 1’(‘Yajia 1’)以及作為對(duì)照的品種‘無(wú)’(‘Wu’)［2］。

從各品種的多棵樣株上隨機(jī)選取10片生長(zhǎng)正常且大小一致的葉片［3］，用 FAA(含體積分?jǐn)?shù)70%乙醇)固定。

1.2 石蠟切片制作方法

取固定后的油茶葉片，依次用體積分?jǐn)?shù)50%、70%、85%、95%和100%乙醇(重復(fù)1次)、V(100%乙醇)∶V(二甲苯)=1∶1(重復(fù)1次)、二甲苯(重復(fù)2次)梯度脫水和透明;然后逐級(jí)透蠟，透蠟時(shí)間為2 d。用石蠟切片機(jī)切片，切片厚度10 μm，番紅－固綠對(duì)染，用中性樹(shù)膠封片制成永久切片。

1.3 觀察和測(cè)量方法

用Motic顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行觀察并拍照。利用Motic軟件進(jìn)行測(cè)量，并用MATLAB軟件對(duì)葉片解剖特征進(jìn)行聚類(lèi)分析［4］。

葉片橫切面(除中脈)解剖結(jié)構(gòu)特征包括葉片厚度、柵欄組織厚度和細(xì)胞層數(shù)、海綿組織厚度和細(xì)胞形狀、柵欄組織與海綿組織的厚度比、上表皮厚度和下表皮厚度。每個(gè)品種隨機(jī)選取10片葉片，每一葉片選3個(gè)橫切面切片，每張切片觀察3個(gè)視野，每個(gè)視野分別測(cè)量1個(gè)數(shù)據(jù)，即每個(gè)品種每項(xiàng)解剖特征測(cè)量90組數(shù)據(jù)，計(jì)算其平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。并按以下公式［5］計(jì)算葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度(leaf tissue structure loose ratio，RL)和葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度(leaf tissue structure tense ratio，RT):RL=(海綿組織厚度/葉片厚度)×100%;RT=(柵欄組織厚度/葉片厚度)×100%。

葉片中脈解剖結(jié)構(gòu)特征包括葉片中脈厚度、木質(zhì)部厚度、韌皮部厚度、維管束短徑、韌皮部厚度與維管束短徑比、木質(zhì)部厚度與維管束短徑比、維管束短徑與葉脈厚度比。每個(gè)品種隨機(jī)選取10片葉片，每一葉片選取3個(gè)中脈橫切面切片，每張切片觀察3個(gè)視野，每個(gè)視野分別測(cè)量1個(gè)數(shù)據(jù)，每個(gè)品種每一指標(biāo)共獲得90組數(shù)據(jù)。按以下公式［5］計(jì)算葉片中脈突起度(midrib protuberant degree，MPD):MPD=葉片中脈厚度/葉片厚度。

2 結(jié)果和分析

2.1 葉片橫切面解剖結(jié)構(gòu)比較

供試61個(gè)油茶品種葉片橫切面的解剖結(jié)構(gòu)及各指標(biāo)的測(cè)量數(shù)據(jù)見(jiàn)圖版Ⅰ和表1;葉片中脈橫切面的解剖結(jié)構(gòu)及各指標(biāo)的測(cè)量數(shù)據(jù)見(jiàn)圖版Ⅱ和表2;部分品種葉肉組織中晶體和石細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖版Ⅲ。

表1 不同油茶品種葉片橫切面解剖特征比較(±SD)1)Table 1 Comparison of anatomical characteristics of leaf transection of different cultivars of Camellia oleifera Abel(±SD)1)

表1 不同油茶品種葉片橫切面解剖特征比較(±SD)1)Table 1 Comparison of anatomical characteristics of leaf transection of different cultivars of Camellia oleifera Abel(±SD)1)

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續(xù)表1 Table 1(Continued)

2.1.1 葉片橫切面(除中脈)解剖特征分析 從表1和圖版Ⅰ可以看出:供試的61個(gè)油茶品種葉片(除中脈外)橫切面均由上表皮和下表皮以及柵欄組織和海綿組織構(gòu)成，葉片多為典型的異面葉。

油茶葉片的上表皮和下表皮均由1層排列緊密的近方形扁平細(xì)胞組成，上表皮厚度為19.00～36.18 μm，下表皮厚度為14.05 ～35.45 μm，大多數(shù)油茶品種葉片上表皮的厚度大于下表皮;有表皮毛;上表皮和下表皮均被角質(zhì)層，且均在中脈處有所加厚;供試61 個(gè)品種的葉片厚度為 401.13 ～729.68 μm。柵欄組織由2～4層長(zhǎng)柱形細(xì)胞組成，排列緊密，細(xì)胞層數(shù)多為3～4 層，厚度為116.8 ～271.3 μm;海綿組織細(xì)胞形狀多為橢圓形，排列較疏松，細(xì)胞間隙較大，厚度為198.2～518.4 μm。柵欄組織厚度與海綿組織厚度的比值為0.225～1.013，葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度為38.8% ～89.5%，葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度為17.2% ～44.6%。差異顯著性分析結(jié)果表明:上述各指標(biāo)在供試61個(gè)油茶品種間均存在顯著差異(P＜0.05)。

另外，在大部分葉片組織中含有石細(xì)胞和晶體。石細(xì)胞多集中在葉脈附近，晶體散布在海綿組織的大細(xì)胞內(nèi)(圖版Ⅲ)。

2.1.2 葉片中脈橫切面解剖特征分析 從圖版Ⅱ可以看出:葉片中脈在葉片的上表皮和下表皮處均形成突起，中脈由厚角組織、維管束和維管束鞘組成。厚角組織由大而圓的薄壁細(xì)胞構(gòu)成;維管束呈扇形，維管束鞘由2層薄壁細(xì)胞組成。維管束包含木質(zhì)部、韌皮部和形成層3部分;木質(zhì)部位于近軸端，韌皮部位于遠(yuǎn)軸端，且木質(zhì)部多于韌皮部。

由表2可見(jiàn):油茶葉片的中脈厚度為532.6～1 317.8 μm，其中，木質(zhì)部厚度 116.1 ～364.2 μm，韌皮部厚度 40.0 ～181.8 μm。維管束短徑 171.8 ～529.5 μm，中脈突起度為 1.029 ～2.041，韌皮部厚度與維管束短徑比為0.197～0.431，木質(zhì)部厚度與維管束短徑比為0.578～0.797，維管束短徑與中脈厚度比為0.253～0.659。差異顯著性分析結(jié)果表明:上述各指標(biāo)在供試61個(gè)油茶品種間差異顯著(P＜0.05)。

表2 不同油茶品種葉片中脈橫切面解剖特征比較(±SD)1)Table 2 Comparison of anatomical characteristics of midrib transection of leaf of different cultivars of Camellia oleifera Abel(±SD)1)

表2 不同油茶品種葉片中脈橫切面解剖特征比較(±SD)1)Table 2 Comparison of anatomical characteristics of midrib transection of leaf of different cultivars of Camellia oleifera Abel(±SD)1)

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續(xù)表2 Table 2(Continued)

2.2 基于葉橫切面解剖學(xué)性狀的聚類(lèi)分析

基于葉片及中脈橫切面解剖結(jié)構(gòu)特征對(duì)供試的61個(gè)油茶品種進(jìn)行聚類(lèi)分析，其聚類(lèi)分析的樹(shù)狀圖見(jiàn)圖1。

聚類(lèi)分析結(jié)果顯示:基于葉片和中脈橫切面解剖結(jié)構(gòu)特征，可將供試的61個(gè)油茶品種分為13個(gè)組，其中，品種‘dy46’、‘長(zhǎng)林 27號(hào)’、‘長(zhǎng)林 21號(hào)’、‘fy7’、‘hy114’、‘dy156’、‘湘 5’、‘長(zhǎng)林 91 號(hào)’、‘長(zhǎng)林185號(hào)’和‘長(zhǎng)林219號(hào)’分別單獨(dú)成組(分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ組);品種‘hy1’和‘hy17’聚為一組(Ⅺ組);品種‘長(zhǎng)林15號(hào)’、‘長(zhǎng)林81號(hào)’、‘長(zhǎng)林 90號(hào)’、‘長(zhǎng)林 94號(hào)’、‘長(zhǎng)林 145號(hào)’和‘長(zhǎng)林152號(hào)’聚為一組(Ⅻ組);供試的其他43個(gè)油茶品種聚為一組(ⅩⅢ組)。

圖1 基于葉片橫切面解剖特征的61個(gè)油茶品種的聚類(lèi)圖Fig.1 Cluster dendrogram of 61 cultivars of Camellia oleifera Abel based on anatomical characteristics of leaf transection

2.3 分類(lèi)檢索表

為便于油茶品種的鑒定和評(píng)估，綜合油茶品種葉片解剖特征的觀察結(jié)果，對(duì)聚類(lèi)分析劃分的13個(gè)組編制相應(yīng)的分類(lèi)檢索表:

基于葉片橫切面解剖特征的13組油茶品種的分類(lèi)檢索表

3 討 論

3.1 葉片解剖結(jié)構(gòu)的差異分析

供試61個(gè)油茶品種中，長(zhǎng)林系列品種是從來(lái)源不同的野生油茶上通過(guò)嫁接獲得的品種，而紅花油茶系列品種以及湘林、贛、桂無(wú)、桐、亞家、閩優(yōu)系列品種均代表來(lái)自不同地區(qū)的油茶品種。它們?cè)谌~片解剖結(jié)構(gòu)上具有不同特征，具體表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:

1)表皮厚度:不同油茶品種間上、下表皮厚度的變異幅度較大。其中，品種‘長(zhǎng)林91號(hào)’葉片上表皮厚度和下表皮厚度都較薄，說(shuō)明該品種抗寒能力較弱;品種‘長(zhǎng)林27號(hào)’上、下表皮厚度都較厚，說(shuō)明該品種抗寒能力較強(qiáng)，且其中脈突起程度明顯，也是其抗寒能力較強(qiáng)的佐證之一［6］。

2)葉片和中脈厚度:不同品種間葉片和中脈厚度變幅較大。其中，‘長(zhǎng)林219號(hào)’、‘fy7’和‘hy114’中脈較厚，‘長(zhǎng)林97號(hào)’、‘長(zhǎng)林87號(hào)’和‘長(zhǎng)林96號(hào)’中脈厚度較小;‘長(zhǎng)林15號(hào)’、‘fy7’和‘hy114’葉片較厚，‘長(zhǎng)林96號(hào)’、‘長(zhǎng)林97號(hào)’和‘長(zhǎng)林89號(hào)’葉片較薄，可以看出葉片厚度與中脈厚度呈一定的正相關(guān)關(guān)系?！L(zhǎng)林219號(hào)’和‘hy114’的中脈突起度相對(duì)較大，‘長(zhǎng)林96號(hào)’和‘長(zhǎng)林97號(hào)’的中脈突起度相對(duì)較小，說(shuō)明中脈突起度與葉片厚度、中脈厚度有一定的正相關(guān)關(guān)系。中脈突起度與葉片水分運(yùn)輸有關(guān)，所以紅花油茶系列品種的耐旱性較強(qiáng)。

3)葉肉組織結(jié)構(gòu):不同品種的柵欄組織和海綿組織厚度變幅均較大，其中海綿組織厚度變幅大于柵欄組織厚度;由此也導(dǎo)致葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度和緊密度變異較大。其中，‘長(zhǎng)林162號(hào)’和‘長(zhǎng)林82號(hào)’的葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度較大，‘dy156’、‘fy7’、‘hy114’、‘hy17’和‘hy1’葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度較小，但它們的中脈突起度都比較大，說(shuō)明紅花油茶系列品種葉片柵欄組織不是很發(fā)達(dá)，光合效率不高且耐寒性弱［7］。

3.2 油茶耐寒性與葉解剖結(jié)構(gòu)的關(guān)系分析

基于前期關(guān)于耐寒性的研究結(jié)果，結(jié)合葉片解剖結(jié)構(gòu)的觀察結(jié)果，可以認(rèn)為:葉片厚度、葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度和疏松度等指標(biāo)與油茶的抗寒性關(guān)系不大，而葉片上表皮厚度、氣孔密度和中脈突起度等指標(biāo)與抗寒性關(guān)系密切;氣孔密度小、葉表皮厚且中脈突起度大，則抗寒性強(qiáng);反之則抗寒性弱［8］。

3.3 油茶品種間親緣關(guān)系的分析

通過(guò)聚類(lèi)分析可將供試的61個(gè)油茶品種分為13個(gè)組，其中，閩優(yōu)系列品種均來(lái)自福建，表現(xiàn)出較近的親緣關(guān)系?！甴y1’與‘hy17’同為紅花油茶系列，表現(xiàn)出一定的相似性。另外，不同的分組具有各自的顯著特征，如:組Ⅱ、組Ⅶ和組Ⅹ品種的中脈突起度與其他分組差異較明顯;組Ⅲ和組Ⅻ品種的韌皮部厚度與其他分組差異較明顯;組Ⅳ品種在葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度上與其他分組差異較明顯;組Ⅴ品種在葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度上與其他分組有明顯差異;組Ⅸ品種在維管束短徑長(zhǎng)度上與其他分組差異明顯。

因此，油茶葉的解剖學(xué)特征可作為區(qū)分種或品種的依據(jù)，對(duì)種間親緣關(guān)系探討具有一定意義。

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