黃艷，周肸，趙鳳鳴，吳勉華，周學(xué)平，王明艷

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210029)

出血性中風(fēng)是臨床常見的急危重癥，急性期若有效治療能很好的控制病情，降低病死率和致殘率。國醫(yī)大師周仲瑛教授創(chuàng)制的涼血通瘀法臨床治療出血性中風(fēng)急性期瘀熱阻竅證患者，療效明顯［1］。涼血通瘀方主要由熟大黃、水牛角、赤芍、丹皮等中藥組成。前期研究結(jié)果表明，涼血通瘀方能改善急性出血性中風(fēng)患者凝血和炎癥相關(guān)指標(biāo)。為了探究涼血通瘀方治療急性出血性中風(fēng)的分子機(jī)制，本文在前期臨床研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過體外實(shí)驗(yàn)，觀察了涼血通瘀方對TNF－α、HSP70、NO 及 NOS的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

1．1 實(shí)驗(yàn)用藥

涼血通瘀方:熟大黃，水牛角、赤芍、丹皮等藥材均購自南京中醫(yī)藥大學(xué)門診部，由南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定，符合《中國藥典》2005年版標(biāo)準(zhǔn)。

含藥血清的制備:藥液浸泡1h，水牛角先煎，所有藥材煎煮30min后過濾1次，剩余藥液加水煎煮30min，取濾液，合并2次濾液濃縮至55ml(濃度為2g/ml)。20只清潔級大鼠(體質(zhì)量250g左右，雌雄各半)，隨機(jī)分成正?？瞻讓φ战M，高、中、低劑量組，連續(xù)灌胃3天，最后1次灌胃后1h取血，分離血清，滅活，過濾，分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

藥液制備:取水牛角泡30min，加10倍量蒸餾水煎煮沸騰后20min，加入熟大黃，赤芍，丹皮，生地黃，廣地龍，三七等，加10倍量蒸餾水煎煮沸騰后20min，過濾，倒出藥液，藥渣加入10倍量蒸餾水煎煮沸騰后20min，過濾，合并2次濾液，濃縮至220ml作為原液，置4℃冰箱保存［2］。原液用單倍稀釋，分為兩個(gè)用藥組，其濃度分別為3000ug/ml(臨床等效量)、300ug/ml，空白對照組用生理鹽水。

1．2 試劑

TNF－α ELISA試劑盒(美國RND公司);HSP－70 ELISA試劑盒(USCNLIFE);NO、NOS試劑盒(南京建成生物工程研究所，批號20120328)，RPMI 1640 培養(yǎng)基(Gibco公司);小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品);PHA(上海澤龍生物工程有限公司，批號20115102)。

1．3 儀器

3111 型CO2 培養(yǎng)箱(FORMA SCIENTIFIC公司);IX50 倒置顯微鏡(Olympus公司);Micropat Reader550型酶聯(lián)免疫檢測儀(日本，Bio－Rad公司);LD4－2A離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);HHW21．CU 600 電熱恒溫水溫箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠);超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2．1 臨床病例選擇

臨床病例遵循知情同意原則納入，診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《中風(fēng)病診斷療效評定標(biāo)準(zhǔn)》［3］及《各類腦血管疾病的診斷要點(diǎn)》［4］。

2．2 樣本采集

取患者全血置含有肝素的離心管。

2．3 全血培養(yǎng)

取新鮮抗凝血接種到6 孔板，每孔0．4ml，4ml 1640 全培，PHA 0．2 ml，5%CO237℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48h，加藥0．51ml，5%CO2，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，收集上清。

2．4 ELISA法檢測相關(guān)細(xì)胞因子TNF－α、HSP70

準(zhǔn)備試劑、樣品盒標(biāo)準(zhǔn)品，加入準(zhǔn)備好的樣品、標(biāo)準(zhǔn)品以及酶聯(lián)親和物，37℃反應(yīng)60min，洗板5次，加入顯色液 A/B室溫避光反應(yīng)15min，加入終止液，30min內(nèi)用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線換算所測細(xì)胞因子含量。

2．5 試劑盒測NO及NOS

依照試劑盒說明書上要求分別配制各檢測試劑，按操作表順序分別加樣。上清加樣量100μL。完成程序后，用分光光度計(jì)進(jìn)行比色，NO檢測波長550nm，NOS檢測波長530nm，將所得數(shù)據(jù)按說明書上所提供的公式分別計(jì)算上清中NO、NOS水平。

NO(umol/l)=(測定管吸光度－空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度－空白管吸光度)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(100umol/l)×樣品測試前稀釋倍數(shù)

總NOS(u/ml)=(總測定管OD值－空白管OD值)/呈色物納摩爾消光系數(shù)×(反應(yīng)液總體積/取樣量)×1/(比色光徑×反應(yīng)時(shí)間)/1000

2．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 11．5 軟件進(jìn)行組間t檢驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)處理后結(jié)果見表1、2。

3 結(jié)果

3．1 涼血通瘀方對外周血中 TNF－α、HSP－70的影響

涼血通瘀方藥液組和空白對照組相比，TNF－α的含量下降，其中藥液3000組(終濃度為300ug/ml)的TNF－α含量明顯下降(P＜0．05);含藥血清高、中、低三個(gè)劑量組和空白血清對照組相比，TNF－α的含量皆下降，而HSP－70的含量升高，其中三個(gè)劑量組TNF－α的含量都明顯下降(P＜0．05)，中劑量組和低劑量組HSP－70的含量明顯升高(P＜0.05)。見表1。

3．2 涼血通瘀方對外周血中NO及NOS的影響

涼血通瘀方藥液3000組(終濃度為300ug/ml)和空白對照組相比，NOS活性和NO含量均明顯升高(P＜0．05);含藥血清高、中、低三個(gè)劑量組和空白血清對照組相比，NOS活性和NO含量均明顯升高(P＜0.05)。見表2。

表1 涼血通瘀方作用后外周血中TNF－α、HSP70的含量(±s，n=4)

表1 涼血通瘀方作用后外周血中TNF－α、HSP70的含量(±s，n=4)

注:與空白對照組比較，*P＜0．05;與空白血清對照組比較，△P＜0．05。

95．49 ±8．8 3．12 ±1．17藥液300 89．76 ±22．36 2．50 ±2．55藥液3000 80．94 ±8．77* 2．27 ±0．61空白血清對照組 102．24 ±4．57 5．02 ±0．68高劑量組 89．79±6．07△ 6．92±2．57中劑量組 94．34±5．27△ 6．15±1．15△低劑量組 89．91±2．67△ 7．46±0．47空白對照組△

表2 涼血通瘀方作用后外周血中NO、NOS的含量(±s)

表2 涼血通瘀方作用后外周血中NO、NOS的含量(±s)

注:與空白對照組比較，*P＜0．05;與空白血清對照組比較，△P＜0．05。

93．55 ±8．11 0．31 ±0．11藥液300 107．18 ±11．37藥液3000 124．47 ±12．72* 1．46 ±0．83*空白血清對照組 105．6 ±16．29 0．49 ±0．17高劑量組 157．0 ±9．41△中劑量組 142．05±17．36△ 0．94±0．37△低劑量組 132．96 ±11．52空白對照組△

4 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，涼血通瘀方的藥液和含藥血清都可一定程度的降低出血性中風(fēng)患者外周血中TNF－α的表達(dá)。TNF是一種重要的免疫調(diào)節(jié)和促炎癥細(xì)胞因子，TNF－α為其主要亞型，主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生［5］。很多研究顯示，腦出血后TNF－α?xí)?。史福平?］等研究結(jié)果顯示，腦出血患者血漿TNF－α水平明顯高于正常對照組。楊清［7］等研究結(jié)果顯示，急性腦血管病患者血清TNF－α含量明顯高于正常對照組。廖鑫［8］等研究結(jié)果表明，高血壓性腦出血患者血清炎癥因子TNF－α的水平顯著升高。還有研究顯示，機(jī)體內(nèi)高水平的TNF－α可直接損傷血管的內(nèi)皮細(xì)胞，造成血管內(nèi)皮功能失調(diào)［9］。前期有臨床實(shí)驗(yàn)提示，涼血通瘀方對出血性中風(fēng)患者TNF－α的表達(dá)有影響，通過本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)一步推測，涼血通瘀方可能通過作用于外周血中的單核細(xì)胞，降低了TNF－α的表達(dá)，減輕了機(jī)體炎性反應(yīng)導(dǎo)致的“熱”。

涼血通瘀方含藥血清低劑量組和中劑量組都能使HSP70 表達(dá)顯著增加。HSP70 是一種進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞應(yīng)激蛋白，存在于細(xì)菌到人類的各種生物中。在腦出血等應(yīng)急狀態(tài)下，當(dāng)其他蛋白合成受抑制時(shí)，HSP70 表達(dá)反而增加［10］。HSP70 具有保護(hù)腦細(xì)胞從而具有增加腦細(xì)胞對缺血、缺氧的耐受性，抵抗進(jìn)一步致死性損傷的作用。有研究表明，HSPs在氧化應(yīng)激的過程中調(diào)控蛋白質(zhì)的合成起著重要作用［11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，涼血通瘀方可能通過增加HSP70的表達(dá)對神經(jīng)細(xì)胞發(fā)揮一定的保護(hù)作用。

涼血通瘀方含藥血清可使NO及NOS表達(dá)升高。有關(guān)NO與腦出血的研究已引起了人們的重視，但大多仍限于實(shí)驗(yàn)研究［12］，臨床研究較少，對于中醫(yī)藥與NO研究也較少，故加強(qiáng)對NO的研究工作有利于進(jìn)一步深入了解腦出血的發(fā)病機(jī)理。前期課題組已進(jìn)行了NO及NOS的相關(guān)研究，研究表明，涼血通瘀方可在一定程度上增強(qiáng)NOS活性，促進(jìn)NO的分泌［13］，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證涼血通瘀方對NO及NOS的影響。也進(jìn)一步驗(yàn)證了前期的臨床實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示涼血通瘀方降低TNF－α，升高HSP70，促進(jìn)NO和NOS的表達(dá)可能是其治療出血性中風(fēng)的作用機(jī)理之一。

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