孫麗英，于秋爽，胡曉陽，陳寶忠，馬育軒，高微，秦鵬飛，張亮

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

性早熟是由于兒童發(fā)育提前以致各激素水平升高，性激素的分泌增加，致使第二性征過早的出現(xiàn)。目前認為，女子在8歲前第二性征發(fā)育或9歲前月經(jīng)來潮，男子在9歲前開始性發(fā)育，即可診斷為性早熟［1］。

正常青春期啟動和性早熟發(fā)生時，卵巢黃體出現(xiàn)率、大鼠的卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)均會增大，子宮壁增厚。卵巢黃體的出現(xiàn)是卵巢發(fā)生排卵的直接證據(jù)，是卵巢、子宮功能活動的證據(jù)，故可以通過觀察雌鼠的卵巢、子宮等性器官的組織學檢查，借以判定大鼠的性早熟情況。

1 實驗材料

1．1 實驗動物

取60只清潔級雌性SD大鼠，喂養(yǎng)24日齡時斷奶，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK20080001(黑)。正常喂食飼料和自由飲水。在通風、溫度、濕度適宜的動物室內(nèi)，常規(guī)、適應性飼養(yǎng)1周。

1．2 實驗藥物

龜貞地黃飲:熟地黃24g，龜板12g，山藥12g，山茱萸12g，女貞子12g，茯苓、澤瀉、牡丹皮各9g，知母6g，由黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院制劑室提供。

1．3 實驗儀器

移液器(Gilson公司);光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司生產(chǎn));AL204 電子天平［梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司］;臺式離心機(德國EPPENDORF公司);電熱恒溫水浴鍋(北京長風儀器儀表廠)。

2 實驗方法

2．1 溶液配制 NMA:40mg/kg，溶于0．2ml生理鹽水中;中藥高劑量，30ml/kg;中藥中劑量，15ml/kg;中藥低劑量組，7．5ml/kg。

2．2 模型制備、分組方法、給藥方法

參照前期研究結果［1，2］。

2．3 取材方法

經(jīng)陰道涂片檢查，在確定出現(xiàn)了第一個動情前期時，將該模型組大鼠處死，其余各組按1:1 比例同時用頸椎脫臼法處死大鼠。馬上開腹，取出雙側卵巢和子宮，用電子天平稱量卵巢和子宮的濕重后，將卵巢放入10%甲醛溶液中固定，4℃保存，以備組織病理學檢查。

3 觀察指標及測定方法

3．1 陰道細胞涂片

將消毒的細棉簽(自制棉簽)用生理鹽水濕潤，輕輕插入大鼠陰道內(nèi)，慢慢轉動兩下取出，把帶有陰道內(nèi)含物的棉簽在載玻片上均勻轉動做成涂片，酒精燈烘干后，用堿性美蘭溶液染色5 min后，用蒸餾水沖去多余染液，放到顯微鏡下觀察。并根據(jù)大鼠陰道涂片細胞變化明確大鼠所處性周期階段。見表1。

表1 大鼠發(fā)情各期陰道細胞涂片表現(xiàn)

3．2 子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)

臟器指數(shù)=器官濕重/體重，卵巢指數(shù)和子宮指數(shù)計算公式如下［2］:

再次，山東省雖然不是資源集中地，卻是當之無愧的中國復合肥發(fā)展的前沿陣地和市場先行者。山東臨沂臨沭縣作為“中國復合肥之鄉(xiāng)”，大批復合肥企業(yè)齊聚于此，形成了完備的市場體系，相關附加產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也十分完善，原料、人才、運輸、銷售各方面優(yōu)勢均十分明顯，倍豐鹽湖農(nóng)業(yè)科技坐落于此，占據(jù)了地理優(yōu)勢。

3．3 卵巢黃體出現(xiàn)率

3．3．1 組織固定及石蠟包埋［3］

把卵巢放入10%中性甲醛溶液固定。切取卵巢組織塊約4mm，流水沖洗，然后常規(guī)脫水至透明，進而浸蠟、包埋、切片。

3．3．2 蘇木精－伊紅(HE)染色

蠟塊切片后常規(guī)處理，行HE染色，具體操作步驟嚴格按照說明書進行。光鏡下觀察各組大鼠雙側卵巢黃體的出現(xiàn)情況，黃體出現(xiàn)率為每個卵巢出現(xiàn)的黃體個數(shù)［2］。

4 實驗結果

4．1 陰道細胞涂片

圖1 發(fā)情期(×100)

圖2 發(fā)情后Ⅰ期(×100)

圖3 發(fā)情后Ⅱ期(×100)

圖4 發(fā)情間期(×100)

圖5 發(fā)情前期(×100)

4．2 子宮指數(shù)和卵巢指數(shù) 見表2。

表2 各組大鼠的子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)比較(±s)

表2 各組大鼠的子宮指數(shù)和卵巢指數(shù)比較(±s)

注:與模型組比較，#P ＞0．05，★P ＜0．05。

空白組 10 1．15 ±0．15★ 0．44 ±0．10★模型組 10 2．55 ±0．94 0．70 ±0．62西藥組 10 1．41 ±0．49★ 0．46 ±0．10★中低組 10 2．48 ±0．83# 0．72 ±0．13#中中組 10 1．31 ±0．27★ 0．53 ±0．49★中高組 10 1．45 ±0．55★ 0．49 ±0．65★

結果顯示，中低組與模型組子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)比較無顯著性差異(P＞0．05);空白組、西藥組、中高組、中中組與模型組大鼠子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)比較有統(tǒng)計學意義(P＜0．05);空白組、西藥組、中高組、中中組之間比較子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)無顯著性差異(P＞0．05)。

4．3 卵巢黃體出現(xiàn)率 見表3。

表3 各組大鼠的卵巢黃體出現(xiàn)率比較(±s)

表3 各組大鼠的卵巢黃體出現(xiàn)率比較(±s)

注:與模型組比較，#P ＞0．05，★P ＜0．01。

空白組 10 0．75 ±0．96★模型組 10 4．00 ±0．82西藥組 10 1．25 ±0．96★中低組 10 3．75 ±0．50#中中組 10 2．00 ±0．82★中高組 10 1．00 ±0．82★

結果顯示，中低組與模型組卵巢黃體出現(xiàn)率比較無顯著性差異(P＞0．05);空白組、西藥組、中高組、中中組與模型組大鼠卵巢黃體出現(xiàn)率比較有統(tǒng)計學意義(P＜0．01);空白組、西藥組、中高組、中中組之間比較卵巢黃體出現(xiàn)率無顯著性差異(P＞0．05)。

5 討論

大鼠處于發(fā)情周期的不同階段，陰道粘膜也會隨之發(fā)生不同的變化。陰道粘膜上皮直接受卵巢內(nèi)分泌功能的影響，故對雌激素的反應較為敏感，所以通過觀察陰道細胞涂片可準確地了解卵巢的功能，判定其性周期的變化和第一個發(fā)情間期。由于陰道涂片法判定大鼠性周期具有簡便、準確、實用等優(yōu)點，故此法是目前常用的判定大鼠性周期的方法。

大鼠涂陰道涂片，進一步驗證NMA誘導的雌性大鼠性早熟模型是真性性早熟模型。

實驗結果顯示，中藥高劑量組、中藥中劑量組的子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)均小于模型組，且有統(tǒng)計學意義(P＜0．01);同時與空白組比較無顯著性差異(P＞0.05)，表明龜貞地黃飲能夠在一定程度上減少子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)，抑制卵巢黃體的出現(xiàn)，從而也提示龜貞地黃飲能使大鼠的性腺發(fā)育和功能狀態(tài)維持在正常青春前期水平。

［1］ 孫麗英，高微，胡曉陽，等．中醫(yī)學對兒童性早熟病因病機的認識［J］．中醫(yī)藥學報，2012，40(4):10－11．

［2］ 孫麗英，于秋爽，胡曉陽，等．龜貞地黃飲對性早熟模型大鼠LH、E2含量的影響［J］．中醫(yī)藥學報，2012，40(6):18－19．

［3］ 孫青．滋陰瀉火方干預真性性早熟模型大鼠的實驗研究［D］．南京:東南大學，2006．