黃智慧，馬愛軍，雷霽霖

1. 中國海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266003

2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，青島市海水魚類種子工程與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071

魚類皮膚上皮組織中分布有大量粘液細(xì)胞，所分泌粘液廣泛覆蓋在魚體表面構(gòu)成其與外界直接接觸的第一道門戶，在保護(hù)魚體免遭外界環(huán)境中的病菌、寄生物和病毒侵襲中至關(guān)重要（Huang et al,2009）。普遍認(rèn)為體表粘液中含有抵抗病原微生物入侵的非特異性免疫活性物質(zhì)，尤其自 1969年，F(xiàn)letcher & Grant（1969）提出在血清和粘液中均存在免疫球蛋白后，國、內(nèi)外研究者對魚類粘液的免疫功能產(chǎn)生了濃厚興趣。不斷有學(xué)者證實(shí)魚類體表分泌物中存在補(bǔ)體、溶菌酶、凝集素、C-反應(yīng)體、溶血素、抗菌肽及白細(xì)胞介素IL-1等多種生物活性因子（Alexander & Ingram, 1992; Buchman &Bresciani, 1998; Ingram, 1980）。凝集素作為具有糖專一性、可促進(jìn)細(xì)胞凝集的糖蛋白，為魚類體表粘液中的重要天然免疫因子，且已逐漸成為研究熱點(diǎn)。本文結(jié)合國內(nèi)、外研究成果，對魚類體表粘液凝集素的研究簡史、分類、生物學(xué)性質(zhì)和功能進(jìn)行闡述。

1 魚類粘液凝集素研究簡史

不同于免疫球蛋白，凝集素為不具酶催化活性的蛋白質(zhì)或糖蛋白，能專一、多價(jià)與糖非共價(jià)可逆結(jié)合，并具有凝集細(xì)胞和沉淀聚糖或糖復(fù)合物的作用（Sun, 1994; Zhang, 1999），廣泛存在于生物細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)，在脊椎動物及無脊椎動物的先天性免疫和宿主防御過程中起重要作用，參與異己識別、炎癥反應(yīng)、吞噬作用、細(xì)胞與細(xì)胞之間和細(xì)胞與外界之間的聯(lián)絡(luò)、受精、發(fā)育及再生等過程（Goldstein et al, 1980; Kilpatrick, 2002）。

凝集素最早由Stillmark在1888年從蓖麻籽和紅豆堿中發(fā)現(xiàn)，此后，1919年Sumner從豌豆中分離出結(jié)晶蛋白，命名為 ConA，并用此方法第一次獲得了純凝集素（Xiong et al, 2006）。20世紀(jì)70年代，凝集素獨(dú)特的性質(zhì)引起越來越多學(xué)者的興趣，并在很多生物體中被發(fā)現(xiàn)。Watkins & Morgan（1952）最早從鰻魚中提取得到糖特異性凝集素，后來研究確定為L-fucose 凝集素。20世紀(jì)80年代后，在重組技術(shù)的支持下，魚類凝集素研究有了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，人們從魚體中分離篩選出多種新的具有生物活性的凝集素。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，魚類凝集素在體內(nèi)，如血清、體液、肌肉、血細(xì)胞及受精卵等（Jensen et al, 1997; Russel & Lumsden, 2005; Tateno et al, 2002; Yano, 1997），分布廣泛的同時(shí)，也分布于體外，如魚類體表粘液 （Suzuki et al, 2003）。

魚類皮膚是保護(hù)魚體與水環(huán)境接觸的一道物理和化學(xué)屏障。皮膚粘液除包圍入侵微生物外，還含有抗菌物質(zhì)。其中，凝集素可有效識別和結(jié)合異己物質(zhì)，產(chǎn)生凝集反應(yīng)，從而防止外來微生物等入侵魚體。Kamiya & Shimizu （1980）第一次從斑點(diǎn)犁齒鲆（Lophopsetta maculata）體表粘液中分離出了凝集素，隨后，Ingram（1980）提出了魚類體表含有凝集素，并將其描述為既非抗體類亦非酶類的碳水化合物結(jié)合蛋白。此后 30年，有關(guān)魚類體表粘液凝集素的研究有了更長足的進(jìn)步，研究者們分別從阿拉伯海鲇（Arius thalassinus）、海鰻（Conger myriaster）、歐洲小龍（Repomucenus richardsoniii）、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）、岬羽鼬（Genypterus capensis）等多種魚體表粘液中分離并純化出了凝集素（Goto-Nance et al, 1995; Kamiya et al, 1988; Shiomi et al, 1989, 1990; Toda et al, 1996），不斷證實(shí)凝集素存在于魚類體表，并與體液免疫因子，如免疫球蛋白、補(bǔ)體、溶菌酶和血溶素等，具有同等重要的抵抗病原菌侵入的功能，在魚體天然免疫系統(tǒng)中至關(guān)重要。但當(dāng)時(shí)對體表粘液凝集素蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、分子結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能卻鮮有報(bào)道。Suzuki（1985）、Suzuki & Kaneko （1986）對日本鰻鱺（Anguilla japonica）凝集素紅血球凝集反應(yīng)的研究，提出的該凝集素存在于上皮組織杯形細(xì)胞中的推論，為體表粘液凝集素定位及其生物學(xué)功能研究的首次報(bào)道。其后，Muramoto & Kamiya（1992）對康吉鰻（Conger myriaster）粘液凝集素的氨基酸進(jìn)行測序，并于1999年根據(jù)其蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)提出了康吉鰻體表粘液凝集素包括congerins Ⅰ和congerins Ⅱ兩種結(jié)構(gòu)類型。此后將近8年的時(shí)間里，東京大學(xué)又從日本鰻鱺、紅鰭東方鲀（Takifugu. Rubripes）及頸帶鲾（Leiognathus nuchalis）的體表粘液中分離出了不同的凝集素（Okamoto et al, 2005; Tasumi et al, 2004; Tsutsui et al, 2006），并分別進(jìn)行了結(jié)構(gòu)研究，最終根據(jù)其糖類識別位點(diǎn)（carbohydrate recognition domains,CRDs）的差異以及Ca2+依賴性將魚類體表粘液凝聚素確定為4種類型，此后在其他魚種中發(fā)現(xiàn)的粘液凝集素也大都?xì)w屬于以上 4類（Chen, 2010;Rajan et al, 2011）。

2 體表粘液凝集素結(jié)構(gòu)類型及其功能研究

迄今為止，共鑒定有 4種魚類體表粘液凝集素，即：半乳凝集素、C型凝集素、Lily型凝集素及L-鼠李糖結(jié)合凝集素（Suzuki et al, 2003），表現(xiàn)廣泛的分子多樣性。第1種類型屬于半乳凝素，其中包括從康吉鰻中分離出的 congerins Ⅰ，congerins Ⅱ，以及從日本鰻鱺中分離出的AJL-1，由于此類凝集素可特異性結(jié)合半乳糖或乳糖，故在皮膚粘液中占大多數(shù) （Suzuki, 1985; Suzuki &Kaneko, 1986）。第2種類型是典型的C型凝集素，最早發(fā)現(xiàn)于日本鰻鱺，命名為AJL-2（Tasumi et al,2002）。第3種類型是由紅鰭東方鲀中提取的特異性甘露糖凝集素，結(jié)構(gòu)與單子葉植物凝集素相似，被命名為Lily-type lectin（Suzuki et al, 2003）。第4種提取自頸帶鲾（Leiognathus nuchalis），為特異性乳糖結(jié)合凝集素（PFL-1,PFL-2）（Okamoto et al,2005），由于其與從某些魚卵中所提取的 L-鼠李糖結(jié)合凝集素具有高度同源性，故被歸屬于L-鼠李糖結(jié)合凝集素家族 。另外，近期還發(fā)現(xiàn)了一種存在于魚類體表粘液中的特異內(nèi)源性凝集素（Tsutsui et al,2011），目前尚未確定該凝集素的分類，本文暫將其單列一類。

表1 體表粘液凝集素分類及特征匯總Table 1 Characteristics of skin mucus lectin in fish

2.1 半乳凝集素——galectins

Galectins又稱半乳凝集素，是廣泛存在的主要凝集素類型，具以下特性： Ca2+-不依賴性、特異的β-半乳糖苷酶活性、N-末端封閉、缺少單肽與糖基以及主要定位與細(xì)胞質(zhì) （Kilpatrick, 2000）。Galectin存在于動物體內(nèi)及某些低等脊椎動物的體表粘液中，如非洲爪蟾（Xenopus laevis）（Marschal et al, 1992）以及康吉鰻（congerins Ⅰ和 congerins Ⅱ）等（Suzuki, 1985; Suzuki ＆ Kaneko, 1986）。Tasumi et al（2002）對提取自日本鰻鱺的凝集素——AJL-1的結(jié)構(gòu)研究顯示，其表現(xiàn)β-半乳糖苷酶活性及 Ca2+-不依賴性，N-末端封閉，由 142個(gè)氨基酸殘基組成，無半胱氨酸，未非共價(jià)鍵結(jié)合的二聚體結(jié)構(gòu)，屬于galectin。而對其基因全長的研究則顯示，AJL-1 426 bp的開放閱讀框編碼142個(gè)氨基酸，同源性比較分析表明其與 congerins Ⅱ表現(xiàn)較高相似度（45%），且AJL-1具三個(gè)不同的糖結(jié)合殘基，與congerins Ⅰ結(jié)構(gòu)相似（Shirai et al, 1999）。這些證據(jù)都表明 AJL-1與康吉鰻粘液凝集素同源性較高?；虮磉_(dá)檢測顯示該凝集素僅存在于體表粘液，且表達(dá)含量很高（Kilpatrick, 2000）。AJL-1具有較強(qiáng)的抵抗病原微生物能力，對致病菌、鏈球菌屬均表現(xiàn)凝集活性，是魚類體表粘液中重要的防御因子。

2.2 獨(dú)特的C型凝集素

在動物凝集素中，C型凝集素分布廣泛，功能復(fù)雜，涉及體內(nèi)許多重要的生理、病理過程。C型凝集素成員均含有一個(gè)或多個(gè)特征性糖類識別功能域（CRD），且該功能域能夠通過兩對或三對二硫鍵形成明顯而穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，具有Ca2+-依賴性，其中有14個(gè)恒定殘基（包括4個(gè)C殘基）和18個(gè)保守殘基。大多數(shù) C型凝集素都與 D型甘露糖（D-mannose）、D 型葡糖糖（D-glucose）這一類的Man型配體（Gal-type ligands）或 D型半乳糖（D-galactose）及其衍生物結(jié)合（Kolatkar & Weis,1996）。目前研究最多甘露糖結(jié)合（mannose-binding protein, MBP）C型凝集素是激活免疫系統(tǒng)補(bǔ)體途徑的最主要因子（Dong et al, 2004; Wei et al, 2010;Zhang et al, 2010）。在魚類中，虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、鯉魚（Cyprinus carpio）、大西洋鮭（Salmo salar）、日本牙鲆（Paralichthys olivaceus）以及大菱鲆（Scophthalmus maximus）中的C型凝集素均已被克隆并進(jìn)行了部分功能驗(yàn)證（Kondo et al, 2007;Nakao et al, 2006; Nikolakopoulou & Zarkadis, 2006;Richards et al, 2003; Zhang et al, 2010）。

上述C型凝集素均分布于體內(nèi)，直到2002年，Tasumi從日本鰻鱺體表粘液中分離出凝集素AJL-2，其結(jié)構(gòu)與C-type lectin相似，均具有一段保守性氨基酸序列，以及4個(gè)需要二硫鍵聯(lián)接的保守半胱氨酸殘基。AJL-2具有Ca2+-不依賴性，其基因序列中包括498 bp的開放閱讀框，編碼166個(gè)氨基酸，同源性比對分析發(fā)現(xiàn)其與肋突螈（Pleurodeles），響尾蛇（Crotalus atrox）及小鼠等多個(gè)物種的C型凝集素同源，同源性≥30%。Northern blot分析發(fā)現(xiàn)，AJL-2僅存在于體表，且在魚體上皮組織中的杯型細(xì)胞分泌液泡中積累。凝集反應(yīng)實(shí)驗(yàn)表明，AJL-2的凝集模式與MBP結(jié)合方式相似，對病原菌E.coli K 12具有凝集作用，進(jìn)而抑制細(xì)菌穿透細(xì)胞膜進(jìn)入機(jī)體，或促使細(xì)菌陷入到體表粘液中最終被新分泌出來的粘液沖洗掉而起到保護(hù)魚體的作用（Tasumi et al, 2002）。

Tsutsui et al （2007）由康吉鰻體表粘液中發(fā)現(xiàn)了另一種對酵母菌具凝集活性的甘露糖特異性結(jié)合凝集素，并稱之為 conCL-s，與之前在康吉鰻中發(fā)現(xiàn)的 congerins Ⅰ和 congerins Ⅱ不屬于同一類型。該凝集素為四聚體結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)以二硫鍵結(jié)合且單體分子量為16×103的二聚體組成，其結(jié)構(gòu)屬于C-type lectin家族。conCL-s對酵母菌的結(jié)合表現(xiàn)明顯Ca2+-不依賴性?；虮磉_(dá)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于機(jī)體內(nèi)部和外部粘膜組織中，如皮膚、鰓、舌和食道，在這些組織中，conCL-s對細(xì)菌具有凝集性，且在康吉鰻巨噬細(xì)胞中，lectin結(jié)合微球體可顯著提高細(xì)胞的吞噬作用。這些發(fā)現(xiàn)均表明conCL-s具有調(diào)理素的作用，在體表天然免疫系統(tǒng)中起重要作用。

2.3 Lily型凝集素——pufflectin

Suzuki et al（2003）將從紅鰭東方鲀體表粘液中提取出的pufflectin認(rèn)定為第3種類型凝集素，并命名為“Lily-type lectin”。該凝集素較為特殊，cDNA全長527 bp，包括編碼116個(gè)氨基酸的348 bp開放閱讀框，其上游區(qū)無 ATG翻譯起始位點(diǎn)，即不含單肽的特征常見于半乳凝集素（Kilpatrick, 2000）。Pufflectin氨基酸序列與目前發(fā)現(xiàn)的任何一類動物凝集素均無同源性，卻與單子葉植物的甘露糖凝集素高度同源，如雪花蓮（Galanthus nicalis）、水仙花（Narcissus hybrid cultivar）、韭菜（Allium prorrum）和大蒜（A.sativum）等。這些植物的凝集素都含有三個(gè)甘露糖結(jié)合位點(diǎn)，而pufflectin被證實(shí)含有其中兩個(gè)（Tsutsui et al, 2007）。這類凝集素在體內(nèi)分布廣泛，在鰓、口腔壁、食道以及體表都有表達(dá)。據(jù)報(bào)道，凝集素與細(xì)菌具有特異性凝集現(xiàn)象，而pufflectin與細(xì)菌并不發(fā)生凝集反應(yīng)，但卻對寄生蟲具有凝集活性，這一發(fā)現(xiàn)指出其對魚體在由寄生蟲引起的機(jī)體防御系統(tǒng)中起重要作用。Pufflectin是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與寄生蟲有凝集現(xiàn)象的魚類體表粘液凝集素，證實(shí)了凝集素對細(xì)菌及寄生蟲均具天然免疫功能。

2.4 L-鼠李糖結(jié)合凝集素——PFL-1，PFL-2

第四種類型粘液凝集素為提取自頸帶鲾（ponyfish Leiognathus nuchalis）的特異性乳糖結(jié)合凝集素（PFL-1,PFL-2），cDNA全長1 086 bp,包括693 bp開放閱讀框，編碼231個(gè)氨基酸。PFL-1與從某些魚卵中提取的 L-鼠李糖結(jié)合凝集素高度同源，均擁有一段保守的串聯(lián)重復(fù)序列，故歸屬于L-鼠李糖結(jié)合凝集素家族。但PFL-1僅表達(dá)于體表粘液，而不存在于性腺、鰓、肝臟、脾臟以及腸道。PFL-2與PFL-1 的N-末端氨基酸序列高度相似，被確認(rèn)與PFL-1同型（Okamoto et al, 2005）。該種凝集素亦具有凝集細(xì)菌，阻止其進(jìn)入而保護(hù)魚體的重要免疫功能，但其具體作用機(jī)理尚無報(bào)道。

2.5 新發(fā)現(xiàn)的粘液凝集素

Tsutsui et al（2011）在鯰魚（Silurus asotus）體表粘液中發(fā)現(xiàn)了具甘露糖結(jié)合的 Ca2+-依賴活性的甘露糖結(jié)合凝集素。凝膠過濾結(jié)果顯示，其具有單聚體和二聚體形式，為由308個(gè)氨基酸組成的分泌蛋白，與哺乳動物和魚類內(nèi)源凝集素同源。該凝集素基因在魚類的鰓部、腎和皮膚都有所表達(dá)。抗血清反應(yīng)監(jiān)測顯示，內(nèi)源性凝集素蛋白存在于皮膚和鰓的杯型細(xì)胞、腎臟及血漿。此凝集素對病原微生物具有凝集活性，揭示其在魚類體表抵抗外來細(xì)菌侵入的自我保護(hù)系統(tǒng)中至關(guān)重要。而且，該凝集素的發(fā)現(xiàn)證實(shí)內(nèi)源性蛋白同樣存在于魚類體表粘液，為對凝集素家族功能的補(bǔ)充。目前該凝集素分類尚未確定，暫將其歸為內(nèi)源性凝集素類。隨著分子生物學(xué)、蛋白組學(xué)技術(shù)及測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，通過轉(zhuǎn)錄組文庫、蛋白組圖譜等高端技術(shù)，研究者在其他魚種中發(fā)現(xiàn)了粘液凝集素，如Rajan et al （2011）在對大西洋鱈魚（Gadus morhua）粘液進(jìn)行比較蛋白組學(xué)研究時(shí)，就發(fā)現(xiàn)其存在Galectin-1及甘露糖凝集素（MBL），Bo et al（2012）構(gòu)建感染鰻弧菌青鳉魚（Oryzia melastigma）的消減文庫，Blast比對獲得了其粘液凝集素。但目前尚未深入開展這些凝集素分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及凝集反應(yīng)現(xiàn)象等有關(guān)功能特性的研究。

3 魚類體表粘液凝集素功能性研究展望

凝集素功能性研究開展較早的是植物凝集素，對其生理功能以及分子機(jī)制等都有較深入探究，尤其是為防治病蟲害開拓了新思路。植物凝集素被認(rèn)為是植物防御系統(tǒng)的重要組成部分，目前，更多應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因抗蟲品種的培育及抗病品種的篩選。海洋生物凝集素相對發(fā)展較晚，自 20世紀(jì)70年代后期，其在貝類免疫識別中的作用才為人們所關(guān)注，隨著研究的深入，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)海洋生物凝集素的生物活性絕不遜色于陸生植物凝集素，且水產(chǎn)動物凝集素的研究也已有不少報(bào)道（James &Rowland, 1974；Muramoto et al, 1994）。其中，魚類凝集素通過有效識別和結(jié)合異己物質(zhì)，提高吞噬細(xì)胞對異己物質(zhì)的吞噬、滅殺作用，以及作為免疫活性物質(zhì)保護(hù)機(jī)體的防御功能已得到了越來越多的關(guān)注。

魚類體表粘液及其中所包含的凝集素，以及凝集素的分子結(jié)構(gòu)多樣性在保護(hù)魚體免遭外界環(huán)境中的病菌、寄生物和病毒的侵襲中至關(guān)重要（Huang et al,2009）。粘液凝集素對寄生蟲也表現(xiàn)強(qiáng)烈的凝集活性，同時(shí)，還具有調(diào)理素的功能。因此，掌握其生物功能的多樣性及特殊性，對于了解魚類粘液免疫系統(tǒng)以及抵抗外界環(huán)境脅迫效應(yīng)都有著廣泛的應(yīng)用前景。

日本東京大學(xué)SuzukiYuzuru教授經(jīng)過近10年的研究，目前，已從多個(gè)物種中分離純化出了凝集素，并對其蛋白及分子結(jié)構(gòu)作了詳細(xì)分析和功能驗(yàn)證，根據(jù)其對糖特異性結(jié)合位點(diǎn)及對Ca2+-依賴性等結(jié)構(gòu)性特性進(jìn)行了初步分類。但這些成果對于大規(guī)模凝集素功能性應(yīng)用開發(fā)而言，只是初級階段，關(guān)于體表粘液凝集素的功能性分子機(jī)理以及應(yīng)用性研究仍需進(jìn)一步研究。筆者認(rèn)為，凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、酶、生物素、鐵蛋白及膠體金等結(jié)合，而不影響其生物活性，可用于光鏡或電鏡水平的免疫細(xì)胞化學(xué)研究工作，探究機(jī)體在處于環(huán)境脅迫條件下的體表上皮細(xì)胞分化、增生和惡變的生物學(xué)演變過程，了解病理變化，從而對機(jī)體狀態(tài)作出診斷評價(jià)。而且粘液凝集素對于不同類型的細(xì)菌具有特異凝集活性，可以作為粗略鑒定病原微生物的指示因子。

總之，粘液凝集素作為生物體內(nèi)特殊的糖蛋白，存在于魚體與外界直接接觸的第一道門戶——體表粘液中，在魚類整個(gè)生命過程中至關(guān)重要。它在認(rèn)識和解決魚類集約化、半集約化養(yǎng)殖疾病防治中的重要意義也得到了越來越多的關(guān)注，而且隨著生物工程研究手段和研究領(lǐng)域的不斷擴(kuò)大，對其開發(fā)、利用和生化工程技術(shù)的拓展將具有廣闊應(yīng)用前景。