司道文 楊 鵬 郭艷華 孫敬宇 趙金芝 羅曉燕 程 勇 栗占營 李 云

(河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063000;①唐山市豐潤區(qū)人民醫(yī)院;②開灤總醫(yī)院;③河北大學(xué)附屬醫(yī)院)

腦水腫是創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)后繼發(fā)性損傷的重要病理生理過程。腦損傷后炎癥反應(yīng)引起血管通透性的改變和血腦屏障的功能障礙，最終導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生［1］。環(huán)氧化酶-2(Cyclooxygenase，COX-2)是花生四烯酸代謝初始步驟中的關(guān)鍵限速酶，在腦損傷后的炎癥反應(yīng)和腦水腫中扮演重要的角色［2］。孕酮(Progesterone，PROG)也稱為黃體酮，是天然的孕激素，目前臨床主要用于保護(hù)妊娠及婦科疾病的治療。近年來，孕酮對腦損傷后神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用逐漸受到重視［3］。孕酮對腦水腫的影響已經(jīng)有報道［4］，但是對孕酮降低腦水腫的機(jī)制尚不明確。由于炎癥反應(yīng)是引起腦水腫的重要因素，而且COX-2是重要的炎癥因子。因此，本實驗擬建立大鼠腦損傷模型，利用免疫組織化學(xué)方法檢測大鼠腦組織COX-2表達(dá)，探討孕酮降低腦水腫的機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實驗動物與分組 成年雄性SD大鼠144只，體質(zhì)量250～300g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。按隨機(jī)化原則分為4組，即假手術(shù)組(Sham group)、腦損傷組(TBI group)、安慰劑組(Vehicle group)和孕酮治療組(PROG group)，每組36只大鼠，均設(shè)3個時間點:6h、24h和72h。每個時間點12只大鼠，分別用于COX-2免疫組織化學(xué)檢測和腦水腫測定。

1．2 動物模型建立 采用Feeney’s自由落體硬腦膜外撞擊方法建立模型。大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉，在矢狀縫后1．5mm，中線旁2．5mm處打開一直徑5mm骨窗，用40g的擊錘從25cm處自由墜落沖擊撞桿造成腦損傷。假手術(shù)組僅切開頭皮，開同樣大小骨窗而不造成腦挫傷。孕酮(Sigma公司)溶于22．5%2-羥丙基-β-環(huán)糊精(2-hydroxypropy-p-cyclodextrin，HBC)中，孕酮治療組傷后1h、6h腹腔注射孕酮16mg/kg，以后每天1次皮下注射。安慰劑組在相同時相注射等量HBC溶液。

1．3 免疫組織化學(xué)檢測 分別于傷后各時間點，對大鼠腦組織取材固定，自視交叉后用恒冷箱切片機(jī)連續(xù)冠狀切片，片厚10 μm，貼附于載玻片上待用。COX-2(Cayman公司)免疫組化檢測采用SP法，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。采用CMIAS真彩色醫(yī)學(xué)圖像免疫組化自動分析系統(tǒng)進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)。切片在400倍光鏡下觀察，隨機(jī)取5個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，以平均值代表各區(qū)計數(shù)結(jié)果。

1．4 腦組織含水量測定 于各時間點，大鼠斷頭后快速剝離全腦，距傷灶周圍2mm處取出腦組織，精密電子分析天平測其濕重，然后放入110℃烤箱烘烤24 h，，取出后冷卻10 min后稱干重，按下面公式計算:腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1．5 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)用(x±s)表示，采用 SPSS 16．0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，各組間比較采用方差分析，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義;兩變量間關(guān)系分析采用線性相關(guān)分析，P＜0．05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 孕酮對腦損傷后COX-2表達(dá)的影響 假手術(shù)組COX-2在各個時間點表達(dá)較低;腦損傷組和安慰劑組傷灶周圍皮質(zhì)可見大量COX-2陽性細(xì)胞的表達(dá);孕酮治療組腦損傷周圍皮質(zhì)COX-2表達(dá)明顯減少，與腦損傷組和安慰劑組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，見表 1。

表1 孕酮對腦損傷后各個時間點COX-2表達(dá)的影響(n=6，x±s)

2．2 孕酮對腦損傷后腦水腫的影響 腦損傷組和安慰劑組腦組織含水量明顯增多;孕酮治療后，腦組織含水量顯著減少，與腦損傷組和安慰劑比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)，見表2。同時腦損傷后腦組織含水量與COX-2表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系(r=0．683，P＜0．05)。

表2 孕酮對腦損傷后各個時間點腦水腫的影響(%，x±s)

3 討論

近年來，隨著我國的經(jīng)濟(jì)社會的高速發(fā)展，因交通事故、社會治安及生產(chǎn)事故等原因而引起的腦外傷患者逐年增多，現(xiàn)在腦損傷已經(jīng)成為常見?。?］。腦損傷后炎癥反應(yīng)在繼發(fā)性損傷中具有重要作用。腦損傷后，通過膠質(zhì)細(xì)胞增生，巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，激活釋放細(xì)胞介質(zhì)和炎性因子，從而誘發(fā)和加重血管源性和細(xì)胞毒性腦水腫。炎性因子COX-2在腦水腫的發(fā)病過程中具有重要作用。COX-2催化代謝的過程中產(chǎn)生大量的氧自由基，氧自由基可引起脂質(zhì)過氧化，引起細(xì)胞膜損傷等，可增加血腦屏障的通透性，加劇腦水腫。另外，近年來研究表明，腦損傷后COX-2與iNOS在相同的時間點表達(dá)，并且NO可增強(qiáng)COX-2的催化活性，產(chǎn)生自由基;而COX-2的催化產(chǎn)物氧自由基又可促進(jìn)NO毒性作用，兩者相互作用加重的腦損傷和腦水腫的發(fā)生［6］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，COX-2在腦損傷組和安慰劑組6h有少量表達(dá)，24h達(dá)到高峰，72h仍高于正常水平，與Strauss等［7］用原位雜交技術(shù)檢測腦損傷COX-2mRNA表達(dá)規(guī)律一致。而孕酮干預(yù)組，在各個時間點COX-2表達(dá)均降低，表明孕酮可以降低腦損傷后腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)。對腦水腫的檢測發(fā)現(xiàn)，腦組織含水量在外傷后顯著增加;而給予孕酮后，在各個時間點腦水腫明顯降低;而且COX-2的表達(dá)與腦水腫呈正相關(guān)，表明孕酮可能通過抑制炎癥反應(yīng)而降低腦水腫的發(fā)生。

孕酮是近年發(fā)現(xiàn)的一種非常具有潛力的腦保護(hù)藥物［8］，具有多效性。由于顱腦創(chuàng)傷是一個復(fù)雜的病理生理學(xué)過程，如谷氨酸水平升高、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、氧自由基生成增加、炎性反應(yīng)增強(qiáng)，以及細(xì)胞凋亡與修復(fù)、基因及蛋白質(zhì)表達(dá)改變等;而孕酮可以針對腦損傷后的多個環(huán)節(jié)發(fā)揮作用，這也正是以往腦創(chuàng)傷后，針對單一病理因素治療不能取得良好效果的原因［9］。孕酮可以通過基因機(jī)制和非基因機(jī)制發(fā)揮腦保護(hù)作用［10］，調(diào)節(jié)GABA和NMDA受體活性，而且最近發(fā)現(xiàn)mPRα受體可能在介導(dǎo)炎癥和水腫方面具有重要作用［11］。目前在不同的模型和種屬以及不同的實驗室，均得到了孕酮對腦損傷安全性和有效性的證據(jù)［12］，它的潛在治療價值越來越受到認(rèn)可。

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