,, , ,, ,

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 干部綜合科，遼寧 大連 116011；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 大連 116011 )

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

AOPP對ECV304細(xì)胞表達(dá)SDF-1α的影響及其可能的機制

魏明麗1,丁懷玉2,呂田1,李真1,于紅玖1,王梅1,馬裴裴1

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 干部綜合科，遼寧 大連 116011；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 大連 116011 )

目的觀察晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein product，AOPP)對內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal cell derived factor-1 α,SDF-1α)的影響，并探討其作用機制。方法ECV304細(xì)胞分別經(jīng)0,50,100,200 μmol/L AOPP處理后，用RT-PCR法檢測其SDF-1α mRNA的表達(dá)，觀察AOPP對ECV304細(xì)胞的SDF-1α表達(dá)的影響。ECV304細(xì)胞先經(jīng)NF-κB通路特異性阻斷劑BAY11-7082處理，再經(jīng)AOPP處理，用RT-PCR法檢測其SDF-1α mRNA的表達(dá)，觀察BAY11-7082對AOPP促ECV304 細(xì)胞SDF-1α mRNA 表達(dá)作用的影響。結(jié)果AOPP促進(jìn)ECV304 細(xì)胞SDF-1α mRNA 表達(dá)，并且隨AOPP濃度的升高，SDF-1α mRNA 的表達(dá)增加。對照組、AOPP 50 μmol/L組、AOPP 100 μmol/L組及AOPP 200 μmol/L組SDF-1α mRNA/GAPDH mRNA值分別為0.034±0.005、0.109±0.019、0.226±0.037及0.322±0.043，組間比較差異均有顯著性意義，P<0.05。BAY11-7082抑制AOPP促ECV304細(xì)胞SDF-1α mRNA 表達(dá)，兩組細(xì)胞SDF-1α mRNA/GAPDH mRNA值分別為0.256±0.035和0.322±0.043，P<0.05。結(jié)論AOPP可上調(diào)ECV304細(xì)胞表達(dá)SDF-1α，NF-κB通路可能是介導(dǎo)這一作用的重要途徑之一。

晚期氧化蛋白產(chǎn)物；基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α；NF-κB

晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced oxidation protein products，AOPP)[1]被認(rèn)為是體內(nèi)各種蛋白質(zhì)受到氧化損傷所生成的終末產(chǎn)物的總稱，是隨著慢性腎功能衰竭、動脈粥樣硬化等氧化應(yīng)激相關(guān)疾病[2]的發(fā)生發(fā)展而聚集于患者血漿和組織中的一組性質(zhì)各異的分子?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(stromal cell derived factor-1α,SDF-1α)是由基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一種趨化蛋白，將其歸為CXC亞家族， SDF-1α具有強大的趨化功能[3]。CXCR4是SDF-1α的特異性受體，在血細(xì)胞生成、腫瘤轉(zhuǎn)移及HIV感染等過程中起著重要作用。最近的研究表明SDF-1α/CXCR4 在動脈粥樣硬化斑塊中高表達(dá)[4],且CXCR4 在動脈粥樣硬化形成過程有關(guān)的主要細(xì)胞成分如單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、平滑肌祖細(xì)胞等中均有表達(dá),因此SDF-1α/CXCR4 與動脈粥樣硬化的關(guān)系已經(jīng)引起重視。本研究旨在探討AOPP對內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)SDF-1α的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實驗室提供。

1.2 主要藥品試劑

TAKARA RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0購自TAKARA公司； RPMI1640購自GIBCO 公司；胎牛血清購自杭州四季青生物技術(shù)公司；無內(nèi)毒素牛血清白蛋白(BSA)購自SIGMA公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

ECV304細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃，5%CO2，濕潤的恒溫孵箱中，培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，取第3～5代用于實驗。實驗前，細(xì)胞均經(jīng)過12 h無血清培養(yǎng)。 加入BSA、0、50、100、200 μmol/L的AOPP處理24 h后觀察SDF-1α表達(dá)的改變。

1.4 AOPP-BSA的制備

以 0.01 mol/L PBS(pH 7.4)將 BSA 溶解至 200 mg/mL，將 NaOCl 溶液稀釋至0.2 mol/L(新鮮配制)，各取等量混合(即以 1∶60 摩爾比混合)，室溫孵育 30 min，轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)，4 ℃對 0.01 mol/L PBS(pH 7.4)透析 24 h以去除 NaOCl，每 4～6 h更換透析液1次，按碘量法檢測透析液中的 NaOCl，直至透析液中無 NaOCl，得到AOPP-BSA，0.22 μm 硝酸纖維素膜過濾消毒，分裝后-70 ℃凍存。以紫外分光光度計法，于酸性條件下、340 nm 測定AOPP-BSA粗純品和對照 BSA 樣品中 AOPP 的濃度，以氯胺-T(碘化鉀存在時最大吸收波長為 340 nm)為標(biāo)準(zhǔn)品，實際測定的為 AOPP 對氯胺-T 的相對濃度[1]?？瞻坠?、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管及對照管分別含 100 μL PBS、氯胺-T(0～100 μmol/L)、AOPP-HSA(PBS 1∶50 稀釋)及對照 BSA，各管加入 5 μL 1.16 mol/L 碘化鉀，靜置 2 min，再加入 10 μL醋酸，混勻后立即于 340 nm 測定吸光度。以氯胺-T 的濃度和吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而查出測定和對照樣品中 AOPP 的相對濃度(μmol/L)。應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)定量測定系統(tǒng)(鱟試劑動態(tài)濁度法)進(jìn)行檢測。

1.5 細(xì)胞分組及實驗

實驗一：分別將0,50,100,200 μmol/L AOPP處理后的ECV304細(xì)胞，加入Trizol 試劑提取細(xì)胞總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再對逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR 循環(huán)。其中0 μmol/L AOPP處理后的ECV304細(xì)胞組作為對照組。比較不同濃度的AOPP對ECV304 細(xì)胞SDF-1α mRNA 表達(dá)的影響。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min后94 ℃變性30 s→58 ℃退火45 s→72 ℃延伸1 min，28個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。SDF-1α引物：Sense 5’-AAG CCC GTC AGC CTG AGC TAC-3’，Antisense 5’-AGT TAT CTA CAT CTT GAA CCT CT-3’，預(yù)計擴增產(chǎn)物全長495 bp。GAPDH(內(nèi)參)引物：Sense 5’-TCA CCA TCT TCC AGG AGC GAG-3’，Antisense 5’-TGT CGC TGT TGA AGT CAG AG-3’，預(yù)計擴增產(chǎn)物全長697 bp。反應(yīng)結(jié)束后,反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,凝膠成像系統(tǒng)采集電泳結(jié)果，并應(yīng)用附帶軟件分析目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶吸光度值之比，進(jìn)行半定量PCR。

實驗二：將ECV304 細(xì)胞分兩組,即抑制劑組與非抑制劑組。其中抑制劑組在含20 μmol/L NF-κB抑制劑BAY11-7082 的培養(yǎng)基孵育1 h,之后吸出上述培養(yǎng)基,以無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次,再加入含200 μmol/L AOPP的RPMI 1640 培養(yǎng)液孵育24 h,收集上清液。非抑制劑組直接加入含200 μmol/L AOPP 的RPMI 1640 培養(yǎng)液孵育24 h,收集上清液。按上述方法檢測兩組細(xì)胞SDF-1α mRNA表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 AOPP 對ECV304 細(xì)胞SDF-1α mRNA 表達(dá)的影響

與對照組(AOPP濃度為 0 μmol/ L)比較,不同濃度的AOPP (50 μmol/ L,100 μmol/L,200 μmol/L)均升高SDF-1α mRNA 的表達(dá)(均有P<0.05)。并且隨AOPP濃度的增加，SDF-1α mRNA 的表達(dá)進(jìn)一步升高(圖1，表1)。

圖1 RT-PCR檢測ECV304細(xì)胞經(jīng)0、50、100、200 μmol/L的AOPP處理24 h后的擴增產(chǎn)物電泳

Fig 1 SDF-1α -RT-PCR amplification product electrophoresis in ECV304 cells incubated with different concentrations of AOPP

表1不同濃度AOPP對SDF-1α表達(dá)的影響

Tab 1 The expression of SDF-1α was was up-regulated by AOPP in a concentration-dependent manner (n=6)

組別SDF-1αmRNA/GAPDHmRNA對照組0．034±0．005AOPP50μmol/L組0．109±0．019AOPP100μmol/L組0．226±0．037AOPP200μmol/L組0．322±0．043

各組間比較，均P<0.05

2.2 NF-κB通路阻斷劑BAY 11-7082抑制AOPP促ECV304 細(xì)胞SDF-1α mRNA 表達(dá)作用

抑制劑組細(xì)胞SDF-1α mRNA/GAPDH mRNA值明顯低于非抑制劑組細(xì)胞(分別為0.256±0.035和0.322±0.043，P<0.05)(圖2)。

圖2 兩組細(xì)胞擴增產(chǎn)物電泳

3 討 論

動脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)被公認(rèn)為是一種復(fù)雜的慢性炎性病變,眾多的趨化因子、粘附分子及細(xì)胞因子參與其中[5]。血管內(nèi)皮細(xì)胞對于維持血管正常的生理狀態(tài)具有重要的意義，內(nèi)皮細(xì)胞的功能受到損害或被擾亂都可能影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[6]，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子并與單核細(xì)胞發(fā)生粘附是內(nèi)皮細(xì)胞功能受損而處于激活狀態(tài)的表現(xiàn)之一?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1 alpha,SDF-1α)是一種強趨化因子,其對T細(xì)胞的趨化活性比單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)和巨噬細(xì)胞炎性蛋白1(macrophage inflammatory protein-1,MIP-1)高10倍,且SDF 1α能介導(dǎo)血液中的炎性細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附及向內(nèi)膜下遷移。近來動物水平的研究結(jié)果提示SDF-1α/CXCR4軸與動脈粥樣硬化性疾病密切相關(guān)[3,7]。

AOPP是Witko-Sarsat 等[1]于1996年報道由尿毒癥血液透析(hemodialysis，HD)患者血漿中分離出的含有雙酪氨酸結(jié)構(gòu)的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物，是體內(nèi)各種蛋白質(zhì)受到氧化損傷所生成的終末產(chǎn)物的總稱，是隨著慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)、動脈粥樣硬化(atheroscleosis，AS)等氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展而聚集于患者血漿和組織中的一組性質(zhì)各異的分子。AOPP是通過氯化氧化反應(yīng)在氧化應(yīng)激過程由吞噬細(xì)胞激活生成的次氧酸或氯胺對血清白蛋白氧化作用生成的含雙酪氨酸的蛋白交連物。已知分葉核中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在適宜的刺激下能夠產(chǎn)生呼吸爆發(fā),而后者可以導(dǎo)致高活性的活性氧(reactiveoxygen species,ROS)大量產(chǎn)生。在ROS的形成中,吞噬細(xì)胞具有在髓過氧化酶的作用下生成含氯氧化物能力。髓過氧化酶在氯離子存在的情況下,使過氧化氫生成次氯酸。次氯酸是吞噬細(xì)胞所產(chǎn)生的毒性最強和化學(xué)性質(zhì)最活潑的一類物質(zhì)，AOPP是氯氧化物和血漿蛋白之間的反應(yīng)產(chǎn)物。目前，一些實驗結(jié)果提示AOPP通過氧化修飾LDL，形成的AOPP-LDL能顯著地活化單核/巨噬細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。但是AOPP是否通過直接刺激其他粘附因子的表達(dá)，從而促進(jìn)單核細(xì)胞趨化，及其與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，加速AS的發(fā)生發(fā)展，目前，這方面的研究較少。

本實驗在ECV304細(xì)胞中檢測到低水平的SDF-1α表達(dá)，但經(jīng)過AOPP處理后，SDF-1α的表達(dá)明顯上調(diào)，而且其上調(diào)的程度隨AOPP濃度的增加明顯提高。然而AOPP促進(jìn)ECV304細(xì)胞SDF-1α的表達(dá)機制仍然不清楚。 本實驗發(fā)現(xiàn)AOPP促ECV304 細(xì)胞SDF-1αmRNA表達(dá)的作用可被NF-κB通路特異性阻斷劑BAY11-7082抑制，表明NF-κB通路可能是介導(dǎo)AOPP上調(diào)ECV304細(xì)胞表達(dá)SDF-1α這一作用的重要途徑之一。當(dāng)然，還有其他更多的機制參與其中[8-9]，尚需要進(jìn)一步深入的研究。

[1] Witko-Sarsat V,Friedlander M,Capeillere-Blandin C,et al. Advanced oxidation protein products as a novel marker of oxidative stress in uremia[J]. Kidney Int，1996， 49(5): 1304-1313.

[2] Valente AJ,Yoshidal T,Clark RA,et al. Advanced oxidation protein products induce cardiomyocyte death via Nox2/Rac1/superoxide-dependent TRAF3IP2/JNK signaling[J]. Free Radic Biol Med,2013,60:125-135.

[3] 呂運成，王佐.基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1 alpha， SDF-1α)及其特異受體CXCR4與動脈皺樣硬化[J].中國動脈硬化雜志，2005，13(4)：523-525.

[4] Braunersreuther V,Mach F,Steffens S. The specific role of chemokines in atherosclerosis [J]. Thromb Haemost,2007,97(5):714-721.

[5] Zernecke A,Shagdarsuren E,Weber C. Chemokines in atherosclerosis: an update[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol,2008,28(11): 1897-1908.

[6] 李志，劉衛(wèi)紅，徐維家.內(nèi)皮損傷在血管性疾病發(fā)生發(fā)展中的作用[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009,31(2)：219-223.

[7] Lee KW,Johnson NR,Gao J,et al. Human progenitor cell recruitment via SDF-1α coacervate-laden PGS vascular grafts[J]. Biomaterials,2013,34(38):9877-9885.

[8] Przyklenk K. 'Going out on a limb': SDF-1α/CXCR4 signaling as a mechanism of remote ischemic preconditioning? [J]. Basic Res Cardiol,2013,108(5):382.

[9] Guo ZJ,Niu HX,Hou FF,et al. Advanced oxidation protein products activate vascular endothelial cells via a RAGE-mediated signaling pathway[J]. Antioxid Redox Signal,2008,10(10):1699-1712.

Effectsofadvancedoxidationproteinproductsonexpressionsofstromalcellderivedfactor-1αinECV304cellsandthepossiblemechanism

WEIMing-li1,DINGHuai-yu2,LVTian1,LIZhen1,YUHong-jiu1,WANGMei1,MAPei-pei1

(1.ComprehensiveDepartmentofCadres,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China; 2.CardiovascularDepartment,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China)

ObjectiveTo observe the effect of advanced oxidation protein product (AOPP) on the expression of SDF-1α in ECV304 cells，and to investigate the possible mechanism.MethodsSDF-1α mRNA expressions were revealed by RT-PCR respectively in ECV304 cells preincubated with different concentrations of AOPP. SDF-1α mRNA expression was revealed by RT-PCR in ECV304 cells preincubated with BAY11-7082 which was a inhibitor of NF-κB signal transduction pathway.ResultsSDF-1α expression was constitutionally detected in ECV304 cells and was up-regulated by AOPP in a concentration-dependent manner. The promoting effect of AOPP on the expression of SDF-1α in ECV304 cells could be inhibited by BAY11-7082.ConclusionAOPP could up-regulate SDF-1α expression in ECV304 cells by NF-κB signal transduction pathway.

advanced oxidation protein products; stromal cell derived factor-1α; NF-κB

10.11724/jdmu.2013.06.08

R54

A

1671-7295(2013)06-0543-04

魏明麗,丁懷玉,呂田,等. AOPP對ECV304細(xì)胞表達(dá)SDF-1α的影響及其可能的機制[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2013,35(6):543-546.

魏明麗(1981-)，女，遼寧大連人，主治醫(yī)師，碩士。E-mail：wml810120@hotmail.com

丁懷玉，主治醫(yī)師。E-mail：dhy791211@hotmail.com

2013-08-28；

2013-10-30)