吳云華，孫鵬宇

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，國家民委生物技術(shù)重點實驗室，武漢 430074)

細(xì)胞色素P450(CYP450)酶系是一類血紅蛋白超級家族，因其還原形態(tài)與CO結(jié)合后在450nm處有最大吸收波長而得名.CYP450依賴于氧氣與NADPH催化內(nèi)源性和外源性化合物，以氧化和過氧化發(fā)揮作用.CYP2C9是 P450酶第二亞家族中的一個重要成員，占肝微粒體P450蛋白總量的20％[1,2]，約16％的臨床藥物由CYP2C9代謝[3].

巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)為近年來發(fā)展起來的優(yōu)良酵母表達(dá)系統(tǒng)，它是一類甲醇營養(yǎng)型酵母，在表達(dá)真核細(xì)胞外源蛋白時，不僅生長快、操作簡便、成本低，還具備哺乳類動物細(xì)胞的翻譯后加工和修飾的功能，適用于表達(dá)有生物活性的蛋白[4].細(xì)胞色素P450可在大腸桿菌中表達(dá)，但只有少數(shù)P450在畢赤酵母中成功表達(dá)[5- 9].本實驗利用穿梭表達(dá)載體pPIC3.5k在畢赤酵母中表達(dá)P450，分析其作用性質(zhì)，為研究細(xì)胞色素P450在畢赤酵母中的表達(dá)和催化能力奠定一定的基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

大腸桿菌DH5α、畢赤酵母GS115菌株和質(zhì)粒pPIC3.5K由本實驗室保存.DNA連接酶T4，限制性內(nèi)切酶EcoR I、NotI，DNA聚合酶Pyrobest(TAKARA公司)，遺傳霉素G418(Invitrogen公司)，抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體(康為世紀(jì)公司)，山羊抗鼠IgG二抗(Protein tech 公司)，超敏ECL化學(xué)發(fā)光底物試劑(博士德生物公司)，蝸牛酶、酸洗玻璃珠(Sigma公司).培養(yǎng)基(LB、YPD、MD、BMGY、BMMY)的配制均依照Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊.

1.2 重組菌株的構(gòu)建和胞內(nèi)表達(dá)

1.2.1 pPIC3.5K-2C9表達(dá)質(zhì)粒載體的構(gòu)建

P450 2C9片段用帶有EcoR I位點，插入kozak真核表達(dá)加強(qiáng)序列的上游引物為CCGGAATTCGCCACCATGGCTCGACAATCTTCT，帶有NotI位點并插入6×His標(biāo)簽的上游引物為ATAAGAATGCGGCCGCTCAGTGATGGTGATGGTGATGGACAGGAATGAAGCAC.PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4 min，32個循環(huán)(94℃變性30 s，56.3℃退火30 s，72℃延伸2 min)，72℃延伸7 min.

PCR產(chǎn)物和pPIC3.5K表達(dá)載體用EcoR I和NotI雙酶切，凝膠回收目的片段，T4連接酶16℃連接過夜.熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，轉(zhuǎn)化的菌液涂于氨芐青霉素LB平板，37℃培養(yǎng)過夜.挑取生長的單菌落為模板PCR擴(kuò)增，提取含有目的片段的重組質(zhì)粒DNA，將EcoR I和NotI雙酶切驗證成功的菌落送公司測序.

1.2.2重組轉(zhuǎn)化子的篩選和PCR驗證

按Invitrogen 畢赤酵母表達(dá)手冊，用SalI對重組質(zhì)粒 (pPIC3.5K-2C9)和空載體(pPIC3.5K )分別線性化，再用電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞 GS115，并將轉(zhuǎn)化菌體均勻涂布于MD固體培養(yǎng)基.SalI線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化GS115后，多在HIS4位點上發(fā)生重組，轉(zhuǎn)化子多為Mut+表型，由于質(zhì)粒含有AOX1基因序列，可能在AOX1位點發(fā)生重組，破壞野生型AOX1基因，產(chǎn)生MutS轉(zhuǎn)化子，故將HIS+轉(zhuǎn)化子按順序分別先后點種于MM和MD平板，比較其生長情況以檢測Mut+轉(zhuǎn)化子.

待MD 平板長出HIS+的轉(zhuǎn)化子之后，加入 1～2 mL 無菌水重懸轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)移到50 mL無菌離心管劇烈震蕩，打散細(xì)胞，分光光度計測定細(xì)胞濃度(1OD600= 5×107/mL)，稀釋細(xì)胞懸液，按1×105/mL細(xì)胞涂布含不同G418濃度(0,2.0,4.0 mg/mL)的YPD 平板上，30℃培養(yǎng)，2～5d后篩選具有高G418抗性且生長良好的菌株.挑取檢測后的HIS+轉(zhuǎn)化子用蝸牛酶37℃處理菌體，SDS堿裂解法提取酵母基因組DNA進(jìn)行PCR.用引物5′-AOX:5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′,3′AOX1:5′-AGGCAAATGGCATTCTGACATCC-3′來驗證轉(zhuǎn)化子，PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 5 min，30個循環(huán)(95℃變性1 min,55℃退火1 min,72℃延伸1.5 min),72℃延伸7 min.

1.2.3 P450 2C9畢赤酵母的胞內(nèi)表達(dá)

經(jīng)PCR驗證的GS115-pPIC3.5K-2C9重組菌株和GS115-pPIC3.5K空載體菌株按照Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊在BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=2～6后轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY中.30℃，275 r/min培養(yǎng)，每24 h加入0.5％ (V/V)的甲醇并分別取24,48,72,96 h樣品分析表達(dá)水平.

1.3 重組蛋白的定性檢測

1.3.1 細(xì)胞裂解和SDS-PAGE

收集不同誘導(dǎo)時間菌體于室溫2000×g離心15 min，重懸于buffer A(50 mmol/L磷酸鉀緩沖液,PH 7.6,20％甘油,1mmol/L PMSF)至0.5g /mL，在液氮速凍后貯存于-80℃.細(xì)胞于冰上解凍后，2000×g 4℃離心10 min收集細(xì)胞，重懸于buffer B (50 mM磷酸鉀緩沖液,PH 7.6,20％甘油,1 mmol/L PMSF,1mmol/L EDTA,10 mmol/L β-巰基乙醇)至0.5g濕菌體細(xì)胞/mL.

加入等量酸洗玻璃珠，渦旋1min，冰上放置1min，重復(fù)10次破碎酵母細(xì)胞.收集破碎后細(xì)胞混合物，取部分于14 000×g 4℃離心30 min，分別收集上清，并將沉淀重懸于buffer B[10].取細(xì)胞混合物、上清和沉淀于冷凍干燥機(jī)濃縮3 h，SDS-PAGE分析濃縮液.

1.3.2 Western blot分析

濃縮后細(xì)胞破碎樣品的上清、混合液和沉淀與SDS-PAGE上樣緩沖液混合后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離.蛋白樣品電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上進(jìn)行Western blot檢測.膜浸于封閉液(5g/100 mL脫脂奶粉,10 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl,pH 8.0,0.05％ Tween-20)封閉2 h.加入抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體(稀釋5000倍)4℃孵育過夜.加入過氧化物標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗(稀釋5000倍)與一抗結(jié)合，雜交箱中孵育1 h.將膜置于保鮮膜上，混合0.5 mL超敏化學(xué)發(fā)光底物試劑 ECL 1與0.5 mL ECL 2，將混合后的工作液加至膜的蛋白質(zhì)面，準(zhǔn)確反應(yīng)1min后，將膜置于另一保鮮膜上，于化學(xué)發(fā)光檢測器中曝光不同的時間，記錄化學(xué)發(fā)光圖像.

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體pPIC3.5K-2C9的載體構(gòu)建

2.1.1 菌落PCR驗證

挑取10個經(jīng)氨芐青霉素篩選成功的單菌落直接PCR，結(jié)果如圖1所示，有5個單菌落可擴(kuò)增約1500 bp的CYP2C9目的片段，說明重組表達(dá)載體pPIC3.5K-2C9的載體構(gòu)建成功.

M)5000bp DNA Marker；1～10)10個單菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.1.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

用EcoRI和NotI雙酶切結(jié)果如圖2所示，可見9000 bp的pPIC3.5K質(zhì)粒和1500 bp的CYP2C9目的片段，進(jìn)一步驗證重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

M)15 000 bp DNA Marker；1～4)重組pPIC3.5K-2C9質(zhì)粒

2.1.3 測序驗證

鑒定正確的重組質(zhì)粒送基因公司雙向測序，結(jié)果表明目的片段插入位點和堿基序列正確，說明CYP2C9基因序列已成功地插入到載體pPIC3.5K的指定位點.

2.2 表達(dá)載體pPIC3.5K-2C9的電轉(zhuǎn)化

2.2.1Mut+表型的篩選

如圖3所示，分別點種于MM和MD平板的HIS+轉(zhuǎn)化子在兩種平板上生長情況沒有明顯區(qū)別，說明轉(zhuǎn)化子沒有發(fā)生MutS表型的突變.

1)MD平板上生長的轉(zhuǎn)化子；2)MM平板上生長的轉(zhuǎn)化子

2.2.2 高抗性重組菌株的篩選

高抗性重組菌株的篩選結(jié)果如圖4所示，收集的轉(zhuǎn)化子5 d后在2.0,4.0 mg/mL的YPD平板上生長.分別得到10個和2個生長較迅速的大菌落,估計是高拷貝整合菌株，分別用于后續(xù)的蛋白質(zhì)的表達(dá).

1)4.0mg/mL的YPD平板生長的轉(zhuǎn)化子；2)2.0 mg/mL的YPD平板生長的轉(zhuǎn)化子

2.2.3 重組菌株基因組的PCR驗證

提取重組的基因組DNA，用AOX1引物和CYP2C9特異引物以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖5.由圖5可見，用AOX1引物可擴(kuò)增出約2200 bpAOX1基因和1700 bp(1500 bp目的基因序列+214 bp載體上序列)的目的片段；用CYP2C9特異引物可擴(kuò)增出1500 bp的目的片段，驗證了重組子中插入了目的序列并且插入方向正確.

M)5000bp DNA Marker；1～4)AOX1引物擴(kuò)增基因組DNA；5～8)CYP2C9特異引物擴(kuò)增基因組DNA

2.3 CYP2C9基因的誘導(dǎo)表達(dá)和鑒定

2.3.1 SDS-PAGE電泳檢測CYP2C9

利用SDS-PAGE電泳檢測CYP2C9結(jié)果見圖6.如圖6所示，在蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為55KD處,CYP2C9重組酵母菌的表達(dá)細(xì)胞上清、混合液、沉淀較陰性對照有差異表達(dá)條帶，但表達(dá)量較低，條帶不十分明顯.

M)蛋白質(zhì)Marker；1)pPIC3.5K空載上清；2～5)分別為誘導(dǎo)24,48,72,96 h上清；6、9)pPIC 3.5K空載混合；7、8、10、11)分別為誘導(dǎo)24,48,72,96h混合；12)pPIC3.5K空載沉淀；13～16)分別為誘導(dǎo)24,48,72,96 h沉淀

2.3.3 重組蛋白的Western Blot檢測

重組的CYP2C9蛋白的Western Blot檢測結(jié)果見圖7.如圖7所示，在55KD處有單一條帶出現(xiàn)，在上清、沉淀中都有檢測到信號，而轉(zhuǎn)化的pPIC3.5K空載體對照菌株未檢測到信號，證明CYP2C9成功地在畢赤酵母中表達(dá).

M)蛋白質(zhì)Marker；1)pPIC3.5K空載上清；2～5)分別為誘導(dǎo)24,48,72,96 h上清；6、9)pPIC 3.5K空載混合；7、8、10、11)分別為誘導(dǎo)24,48,72,96 h混合；12)pPIC3.5K空載沉淀；13～16)分別為誘導(dǎo)24,48,72,96 h沉淀

3 討論

本實驗用人細(xì)胞色素P450 2C9成熟肽編碼區(qū)在畢赤酵母中進(jìn)行甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，由 SDS-PAGE 和Western blotting 分析結(jié)果表明：人細(xì)胞色素P450 2C9 能在畢赤酵母中成功表達(dá)，但CYP2C9的表達(dá)量較低,SDS-PAGE未能檢測到明顯的目的蛋白質(zhì)，推測CYP2C9并不十分適合畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng).據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)，在畢赤酵母中表達(dá)可測水平外源蛋白的概率約為75％.若想獲得CYP2C9在畢赤酵母中的高水平表達(dá)，還需結(jié)合CYP2C9自身特點，如外源基因的結(jié)構(gòu)特點，需符合酵母的偏好密碼子[11]、不含易被蛋白水解酶作用的序列、AT含量不能過高、mRNA的非翻譯區(qū)的長度和序列盡量與AOX基因一致[12]；培養(yǎng)條件的優(yōu)化，包括通氣量、誘導(dǎo)劑甲醇的濃度、培養(yǎng)溫度[13]、培養(yǎng)時間、pH值等[14]，進(jìn)一步分析研究.

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