王朝元，易繼凌，宋 超，魏甜甜，唐俊龍，楊光忠

(1 中南民族大學 生命科學學院，武漢430074；2中南民族大學 藥學院，武漢430074)

接骨草(Sambucuschinensis)為忍冬科接骨木屬，又名陸英、杜仲.主要分布于華北、華南、陜西、甘肅、四川、寧夏等省區(qū).接骨草的根、莖、葉、花和果實均可入藥，有祛風除濕、活血化瘀之功效.在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中，它可治療風濕疼痛、痢疾、黃疸、慢性氣管炎、風疹瘙癢、丹毒、跌打損傷和骨折[1，2]，目前關于接骨草防治骨質(zhì)疏松和促進成骨細胞增殖的報道較多[3]，但其促進骨折愈合的有效成分尚不清楚.

綠原酸(chlorogenic acid ,CGA)是接骨草的化學成分之一，通常存在于杜仲、金銀花、葵花籽粕等植物中[4，5].現(xiàn)有研究表明：CGA具有廣泛的生理活性和藥理活性，如利膽、抗菌、降壓、增加白血球和興奮中樞系統(tǒng)，抗腫瘤，清除自由基等[6-8].故本實驗以成骨細胞MC3T3-E1為體外模型，研究CGA對成骨細胞活性、ALP活性和成骨分化相關基因的影響，以闡明其是否具有促成骨作用，為接骨草的臨床應用提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 試劑和儀器

CGA(SIGMA-ALDRICH公司)，α-MEM培養(yǎng)基(Thermo賽默飛世爾生化制品有限公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，0.25％的胰蛋白酶(Thermo)，青鏈霉素(Thermo)，DMSO(Amresco，0231)，MTT(Amerro)，堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)，BCA蛋白試劑盒(碧云天生物技術研究所)，反轉錄試劑盒(Thermo)，SYBR Green熒光染料(日本TOYOBO公司).

細胞培養(yǎng)瓶(美國Corning公司)，96孔、24孔、6孔培養(yǎng)板(美國Corning公司)，CO2培養(yǎng)箱(HF90/240型，利康生物醫(yī)療科技控股集團)，倒置顯微鏡(Motic AE21型，重慶光學儀器)，酶聯(lián)免疫分析儀(MULTISKAN ASCENT 354型，thermo)，PCR儀(Biometra)，凝膠成像分析儀(JS-380A，上海培清科技)，熒光定量PCR儀(ABI，7500 fast).

1.2 不同濃度CGA的制備

稱取0.05g CGA溶于50 mL α-MEM培養(yǎng)基(無血清)，配制成濃度為1 mg/mL的儲備液.再用含10％血清的α-MEM培養(yǎng)基將CGA儲備液倍比稀釋為11.02,22.05,44.09,88.19μmol/L等處理細胞.

1.3 成骨細胞 MC3T3-E1的培養(yǎng)

取液氮凍存的成骨細胞MC3T3-E1復蘇后，用含有10％胎牛血清的α-MEM完全培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3～4d更換1次培養(yǎng)基，待細胞90％鋪滿瓶底時，用0.25％的胰蛋白酶消化，按1︰2傳代培養(yǎng).

1.4 CGA對成骨細胞增殖率的影響

將生長狀態(tài)良好的MC3T3-E1細胞以5×103/孔接種于96孔板中，置于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).細胞貼壁后，分別加入含上述濃度CGA的培養(yǎng)基，設不加藥為對照組，每組5個復孔，分別培養(yǎng)0,1,3 d后，每孔分別加入20 μL MTT，置于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，反應4 h，小心吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，吹打均勻后，在37℃培養(yǎng)箱中溫育10 min，使其紫色結晶完全溶解，用酶標儀在492nm波長處測定其OD值.

1.5 CGA對成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響

將生長狀態(tài)良好的成骨細胞MC3T3-E1按105/孔接種到24孔板中，置于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待細胞貼壁后加入22.05,44.09 μmol/L藥物(該濃度下對成骨細胞增殖促進作用較好)設不加藥為對照組，每組3個復孔，分別培養(yǎng)2,4,6 d后，按照ALP試劑盒和BCA蛋白試劑盒的操作步驟測定細胞中ALP活性.

1.6 CGA對成骨細胞成骨分化相關基因表達的影響

將生長狀態(tài)良好的MC3T3-E1細胞按2×105/孔接種到6孔板中，置于37℃，5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待細胞貼壁后加入藥物，設不加藥為對照組，每組3個復孔，分別培養(yǎng)2,4,6 d后，用Trizol法提取總RNA，用反轉錄試劑盒合成cDNA，并進行real-time PCR.反應條件：95℃，15s；60℃，15s；72℃，45s；40個循環(huán).以看家基因GAPDH為內(nèi)參，每個樣品設3個復孔，采用2﹣ΔΔCt法[9]檢測成骨分化相關基因的表達，不同骨相關基因PCR引物序列如見表1.

表1 熒光定量PCR引物序列

1.7 統(tǒng)計學處理

根據(jù)公式F=2﹣[(待測組目的基因平均Ct值-待測組內(nèi)參基因平均Ct值)-(對照組目的基因平均Ct值-對照組內(nèi)參基因平均Ct值)],計算出目的基因的相對表達量.用單因素方差分析(one-way ANOVA)對結果進行顯著性差異分析.

2 結果與分析

2.1 CGA對成骨細胞增殖的影響

不同濃度CGA對成骨細胞增殖的影響結果見圖1.如圖1所示，CGA濃度為11.02～88.19μmol/L時，對成骨細胞的增殖均有較好的促進作用，選擇22.05，44.09 μmol/L兩個濃度用于后續(xù)實驗.

1)control；2～5)依次為11.02，22.05，44.09，88.19μmol/L CGA

2.2 CGA對成骨細胞ALP活性的影響

CGA對成骨細胞ALP活性的影響見圖2.由圖2可見，培養(yǎng)2 d時，44.09 μmol/L的CGA能促進成骨細胞MC3T3-E1ALP活性的表達(P<0.01).培養(yǎng)4 d時，CGA對成骨細胞MC3T3-E1ALP活性無顯著影響(P>0.05).隨著培養(yǎng)時間的增加，培養(yǎng)至6d時，22.05、44.09 μmol/L CGA對成骨細胞ALP活性的影響具有抑制作用(P<0.05).

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

2.3 CGA對成骨細胞成骨分化相關基因mRNA表達的影響

CGA對c-fos基因mRNA表達的影響見圖3.由圖3可見，培養(yǎng)2d時，2種濃度的CGA對c-fos基因的表達均有極顯著促進作用(P<0.01)；4d時，44.09 μmol/L CGA對c-fos基因表達的影響逐漸由促進轉為抑制(P<0.05)；6d時，22.05 μmol/L CGA對c-fos基因表達明顯抑制(P<0.01)，呈時間依賴性.

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

CGA對c-jun基因表達的影響見圖4.由圖4可見，22.05 μmol/L CGA短期處理(2～4 d)不影響c-jun基因表達(P>0.05),長期處理(6 d)則表現(xiàn)為抑制作用(P<0.05).44.09 μmol/L CGA處理2 d可顯著促進c-jun基因表達(P<0.01)，長期處理(4～6 d)則具有顯著的抑制作用(P<0.01).故CGA對成骨細胞c-jun基因表達亦呈明顯的時間依賴性.

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA 與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，n=3

CGA對Runx2基因表達的影響見圖5.由圖5可見，其影響呈明顯的時間依賴性.22.05 μmol/L CGA培養(yǎng)2～4d時，對Runx2 基因的表達呈上調(diào)作用(P<0.01)，至6 d時，則表現(xiàn)為強烈的抑制作用(P<0.01).44.09 μmol/L的CGA在短期處理(2d)時，顯著促進Runx2 基因的表達(P<0.01)，但是隨著培養(yǎng)時間的延長，促進作用變成抑制(P<0.01)或沒有顯著影響(P>0.01).

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

如圖6所示，CGA對osterix基因表達的影響也具有明顯的時間依賴性.兩種濃度的CGA短期處理(2 d)時，均極顯著地促進Osterix基因的表達(P<0.01).隨著培養(yǎng)時間的增加(4～6 d)，兩種濃度的CGA處理對成骨細胞osterix表達的促進作用顯著減弱，直至抑制作用(P<0.01).

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

如圖7顯示，與CGA對ALP基因表達的影響與osterix基因類似，也具有明顯的時間依賴性.培養(yǎng)2 d，2種濃度的CGA均促進ALP基因的表達(P<0.05)； 4～6 d時，2種濃度的CGA對ALP基因的表達均具有不同程度的抑制(P<0.05).

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

圖8中CGA對Col-I基因表達的影響也呈明顯的時間依賴性.但與CGA對Osterix和ALP基因表達的影響相反，隨著培養(yǎng)時間的延長，CGA對Col-I基因表達的促進作用增強.在2～6 d，22.05 μmol/L CGA對Col-I基因表達的影響由抑制轉為促進(P<0.01)；而44.09 μmol/L的CGA對Col-I基因表達的影響始終具有促進作用(P<0.05)，隨著培養(yǎng)時間的增加，促進作用愈發(fā)顯著(P<0.01).

1)control；2)22.05 μmol/L CGA；3)44.09 μmol/L CGA

3 討論

MC3T3-E1細胞系是由C57BL/6小鼠顱骨細胞建株的成骨細胞，具有堿性磷酸酶活性，I型膠原合成和基質(zhì)鈣化等成骨細胞的生物學特性，常作為骨代謝研究的細胞模型[10].故本研究以MC3T3-E1細胞系來探討CGA對成骨細胞增殖及活性的影響.

本實驗中，11.02～ 88.19 μmol/L的CGA在不同的時間點對成骨細胞的增殖均具有一定的促進作用，以22.05,44.09 μmol/L的CGA在2個濃度的CGA進行進一步研究.

ALP的表達是成骨細胞分化早期的主要特征之一，是成熟成骨細胞的標志，其活性的高低可反映成骨細胞的活性狀況[11].故本文研究了CGA對ALP活性的影響.在2～6 d，隨著處理時間的延長，22.05 μmol/L CGA對ALP活性的影響由不影響變?yōu)橐种疲?4.09 μmol/L CGA對成骨細胞ALP活性的影響則由促進變?yōu)橐种?，并與隨后的CGA對ALP基因表達的影響結果一致.說明CGA對成骨細胞ALP活性的調(diào)控主要通過對其mRNA轉錄的調(diào)控來實現(xiàn).

Runx2是干細胞向成骨細胞早期分化的重要標志基因，高表達Runx2可激活骨鈣蛋白、骨橋蛋白和骨涎蛋白的轉錄和表達，從而促進成骨細胞成熟[12].Osterix是一種成骨細胞特異性表達的鋅指結構轉錄因子,對成骨細胞的分化起著重要作用.Osterix轉錄受Runx2正性調(diào)控,直接促進前成骨細胞向成骨細胞分化.Osterix能調(diào)控許多重要成骨細胞晚期表型和功能蛋白的表達,如骨鈣蛋白、骨橋蛋白、骨涎蛋白及I型膠原[13].在本研究中，CGA對Runx2和Osterix基因的表達具有顯著的時間依賴性，短期處理可以促進Runx2和OsterixmRNA的表達，隨著處理時間的延長，則表現(xiàn)為抑制作用.這一結果說明CGA短期處理可能促進干細胞向成骨細胞的分化，而長期處理則不利于干細胞向成骨細胞的分化.

十分有意義的是，CGA可以促進成骨細胞Col-I的表達.I型膠原蛋白是成骨細胞分泌的骨主要有機成分，是成骨細胞的分化標志之一[14].本實驗中，除了短期培養(yǎng)(2 d)時，低濃度(22.05μmol/L)的CGA對Col-I基因的表達具有一定抑制作用(P<0.05)，4～6 d，CGA均能顯著促進Col-I基因的表達，并呈時間依賴性.說明合適濃度的CGA對成骨細胞成熟具有正向調(diào)控作用，有助于骨基質(zhì)的形成和骨生長.

原癌基因c-fos產(chǎn)物與其他一些轉錄因子如c-jun表達的癌蛋白結合，形成活性蛋白-1(AP-1)，進而調(diào)控其他基因的轉錄，導致一系列生物學效應的產(chǎn)生，進而促進細胞的分裂增殖[15].在成骨細胞中，c-jun調(diào)控相關基因如骨鈣素、I型膠原、堿性磷酸酶和組蛋白轉錄[16],故c-jun是調(diào)節(jié)成骨細胞增殖分化的基因之一.本研究中，CGA對c-fos和c-jun表達影響具有一定的復雜性，尚需進一步的研究闡明其機理.

綜上所述，CGA具有調(diào)控成骨細胞增殖和分化的能力，CGA可促進成骨細胞的增殖，抑制成骨細胞ALP活性；CGA長期處理不利于干細胞向成骨細胞的分化，它通過促進I型膠原的表達而促進骨成熟分化.故CGA具有一定的成骨活性，是接骨草的成骨活性成分之一.

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