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(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，山東 青島 266003； 2 成都市第二人民醫(yī)院肝膽外科)

腫瘤的快速生長需要消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，而在病理狀態(tài)下新生血管形成的速度跟不上腫瘤的生長速度，因此，無法提供足夠營養(yǎng)物質(zhì)導(dǎo)致腫瘤組織呈現(xiàn)低氧狀態(tài)。低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)在低氧誘導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)節(jié)中起著重要作用，HIF-1α參與維持腫瘤細(xì)胞的能量代謝、新血管形成等。內(nèi)皮抑素(Endostatin)可抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長，從而抑制新血管的生成，進(jìn)一步抑制惡性腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖和遷移，促進(jìn)血管的形成。本研究應(yīng)用免疫組化SABC法分別檢測HIF-1α、Endostatin、VEGF在胰腺癌組織中表達(dá)的變化，分析HIF-1α、Endostatin、VEGF與胰腺癌臨床病理特征關(guān)系及三者間的相關(guān)性，探討三者在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的作用?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科2008—2010年間手術(shù)切除的胰腺癌標(biāo)本35例(臨床資料完整)，術(shù)后病理證實均為胰腺導(dǎo)管腺癌，且術(shù)前均未接受放化療及其他治療。病人男22例，女13例；年齡≤60歲17例，>60歲18例；腫瘤位于胰頭22例，胰體尾13例；高中分化19例，低分化16例；腫瘤直徑≤2 cm者11例，>2 cm者24例。根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC，1997)制定的胰腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ～Ⅱ期24例，Ⅲ～Ⅳ期11例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例。以取自肝移植術(shù)供體正常胰腺組織8例作為對照組。

1.2 HIF-1α、Endostatin和VEGF表達(dá)檢測

采用SABC免疫組織化學(xué)方法，參照SABC試劑盒說明書操作。兔抗人VEGF單克隆抗體、Endostatin抗體購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，兔抗人HIF-1α單克隆抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，SABC試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。實驗采用已知胰腺癌陽性切片作為陽性對照，用PBS液代替一抗孵育已知胰腺癌陽性切片作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

VEGF、Endostatin陽性表達(dá)為棕黃色顆粒，主要位于細(xì)胞質(zhì)；HIF-1α陽性表達(dá)為棕黃色顆粒，主要表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)。在雙盲條件下，由兩名病理科醫(yī)師對切片進(jìn)行觀察，每個位點(diǎn)隨機(jī)選10個高倍視野(200倍)，結(jié)果判定采用半定量積分法分級。①染色強(qiáng)度：0分，無表達(dá)；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。②陽性細(xì)胞百分比：0分，無；1分，1%～25%；2分，26%～50%；3分，51%～75%；4分，>75%。以染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分比兩項計分之和為總積分，總積分0分為(-)，2～3分為(±)，4～5分為(+)，6～7分為()，將(+)和()判定為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計數(shù)資料比較應(yīng)用χ2檢驗，相關(guān)性應(yīng)用Spearman相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胰腺癌組和對照組HIF-1α、Endostatin和VEGF表達(dá)的比較

胰腺癌組織HIF-1α主要表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，陽性率為71.43%(25/35)，對照組無HIF-1α陽性表達(dá)；Endostatin主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，胰腺癌組織陽性率為77.14%(27/35)，對照組為37.50%(3/8)；胰腺癌組織VEGF表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)，陽性率為68.57%(24/35)，對照組無陽性表達(dá)。胰腺癌組織HIF-1α、Endostatin、VEGF表達(dá)均顯著高于對照組，差異均有顯著性(χ2=2.415～13.651，P<0.05)。

2.2 胰腺癌組織HIF-1α、Endostatin、VEGF表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

胰腺癌組織HIF-1α、Endostatin表達(dá)與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=4.418～6.417，P<0.05)；VEGF表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(χ2=6.417～8.670,P<0.05)。見表1。

表1 胰腺癌組織中HIF-1α、Endostatin和VEGF表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 胰腺癌組織中HIF-1α、Endostatin和VEGF表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，胰腺癌組織中VEGF、Endostatin的表達(dá)與HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.662、0.409，P<0.01)；Endostatin表達(dá)與VEGF表達(dá)無相關(guān)性(r=0.218，P>0.05)。

3 討 論

胰腺癌起病隱匿，惡性程度高，進(jìn)展速度快，目前缺乏有效的早期診斷方法，確診時往往已有轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除率低、預(yù)后差。盡管胰腺癌的治療取得了巨大進(jìn)展，但預(yù)后不良的情況卻沒有得到根本改觀。

HIF-1α是一種在哺乳動物組織中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，是低氧狀態(tài)下新生血管生成的重要調(diào)控因子。當(dāng)細(xì)胞低氧時，HIF-1α在細(xì)胞核內(nèi)高表達(dá)，參與新生血管生成的全過程[1-7]。腫瘤新生血管形成在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用，并影響著腫瘤的預(yù)后。腫瘤生長速度快，導(dǎo)致腫瘤組織低氧狀態(tài)，在低氧狀態(tài)下，組織HIF-1α表達(dá)增強(qiáng)，穩(wěn)定性提高，HIF-1α通過多種途徑促進(jìn)新生血管的形成，為腫瘤的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)。本研究結(jié)果表明，HIF-1α在正常組織不表達(dá)，在胰腺癌組織中高表達(dá)并且與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。提示HIF-1α在胰腺癌組織中高表達(dá)促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。

Endostatin可抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長，進(jìn)而抑制新血管的生長。本文的研究結(jié)果顯示，胰腺癌組織中Endostatin表達(dá)高于對照組，差異有顯著意義；胰腺癌組織中Endostatin表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。腫瘤的生長引起新生血管的生長，導(dǎo)致Endostatin在腫瘤組織中高表達(dá)。Endostatin具有抗腫瘤生物活性，抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖，抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的生長。Endostatin抑制淋巴管的生成及淋巴管轉(zhuǎn)移，還可以抑制腫瘤細(xì)胞對血管的侵襲。

VEGF是一種糖蛋白，是1989年由FERRARA等利用硫酸銨析出、肝素瓊脂糖親和層析法及兩次反相高壓液相色譜純化方法，從牛垂體濾泡星狀細(xì)胞培養(yǎng)液中得到的。它是內(nèi)皮細(xì)胞的特異性絲裂原，也是一種有效的血管形成和血管通透性誘導(dǎo)因子，也稱血管滲透因子。VEGF是參與新生血管形成的最有力的因子，促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤新生血管的生成，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。在腫瘤生長過程中，環(huán)境因素和基因變化誘發(fā)血管生成因子上調(diào)或血管生成抑制因子下調(diào)。血管生成因子與其受體結(jié)合，激活內(nèi)皮細(xì)胞分裂增殖，并且促進(jìn)其分泌多種酶，降解基膜，溶解新生血管芽的細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)新生血管的形成。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移都有賴于新生血管的形成。有研究顯示，VEGF在胰腺腫瘤組織中高表達(dá)，VEGF表達(dá)與MVD、腫瘤大小、局部擴(kuò)散直接相關(guān)[8]。本文結(jié)果顯示，VEGF在胰腺癌組織中高表達(dá)，其表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。提示VEGF在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。

本研究還顯示，人胰腺癌組織中VEGF、Endostatin表達(dá)與HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)。腫瘤生長速度快，需要消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，營養(yǎng)物質(zhì)主要來自血液，血液需要血管來運(yùn)輸，腫瘤新生血管形成在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要作用。隨著腫瘤的體積不斷增大，血供不能滿足其生長的需要，腫瘤呈現(xiàn)低氧狀態(tài)，HIF-1α在低氧狀態(tài)時表達(dá)增高，穩(wěn)定性增強(qiáng)，增多的HIF-1α通過與其靶基因結(jié)合促進(jìn)新生血管的形成，為腫瘤的生長提供營養(yǎng)物質(zhì)。其中VEGF是HIF-1α最重要的靶基因。本文的結(jié)果顯示，HIF-1α、Endostatin、VEGF在胰腺癌組織中均有表達(dá)，且三者表達(dá)均顯著高于對照組；VEGF、Endostatin的表達(dá)與HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)。由此可推斷，HIF-1α表達(dá)增多誘導(dǎo)胰腺癌組織內(nèi)低氧，低氧環(huán)境使VEGF表達(dá)增多，并導(dǎo)致拮抗因子Endostatin在腫瘤組織中高表達(dá)。Endostatin抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂增殖，抑制腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤的生長。本文結(jié)果還顯示，胰腺癌組織HIF-1α、Endostatin表達(dá)與腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；VEGF表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。HIF-1α、Endostatin的檢測可能有助于胰腺癌的早期診斷。

綜上所述，腫瘤細(xì)胞快速生長造成組織低氧狀態(tài)，誘導(dǎo)HIF-1α高表達(dá)，而HIF-1α的高表達(dá)又促進(jìn)VEGF的高表達(dá)，VEGF高表達(dá)促進(jìn)血管內(nèi)皮增殖分裂，進(jìn)而促進(jìn)血管形成，從而促進(jìn)腫瘤生長。而Endostatin可以通過阻斷VEGF通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，有效抑制血管生成。HIF-1α、Endostatin、VEGF三者相互作用共同參與新生血管的生成，在胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移中起重要作用。

[1] 成立紅,徐珞. 子宮內(nèi)膜癌組織Livin、HIF-1Α和VEGF表達(dá)及意義[J]. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2011,47(1):47-49.

[2] PHILIP P A, MOONEY M, JAFFE D, et al. Consensus report of the national cancer institute clinical trials planning meeting on pancreas cancer treatment[J]. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology, 2009,27(33):5660-5669.

[3] SIEGEL R, NAISHADHAM D, JEMAL A. Cancer statistics, 2012[J]. CA: a Cancer Journal for Clinicians, 2010,62(1):10-29.

[4] MATSUNO S, EGAWA S, FUKUYAMA S, et al. Pancreatic cancer registry in Japan: 20 years of experience[J]. Pancreas, 2004,28(3):219-230.

[5] 張清華,王言奎. 宮頸癌組織HIF-1α和IGF-2表達(dá)及意義[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2011,26(1):8-10.

[6] RICHTER A, NIEDERGETHMANN M, STURM J W, et al. Long-term results of partial pancreaticoduodenectomy for ductal adenocarcinoma of the pancreatic head: 25-year experience[J]. World Journal of Surgery, 2003,27(3):324-329.

[7] FARNELL M B, PEARSON R K, SARR M G, et al. A prospective randomized trial comparing standard pancreatoduodenectomy with pancreatoduodenectomy with extended lymphadenectomy in resectable pancreatic head adenocarcinoma[J]. Surgery, 2005,138(4):618-628.

[8] 尹麗,李東野. 低氧誘導(dǎo)因子-1的低氧調(diào)節(jié)及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[J]. 心血管病學(xué)進(jìn)展, 2006,27(z1):93-98.