沈 輝 , 萬夕和 王李寶 費榮梅, 李 淑, 柏 玲, 凌 云 黎 慧 高 波

(1. 江蘇省海洋水產(chǎn)研究所, 江蘇 南通 226007; 2. 上海海洋大學(xué), 上海 201306; 3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué), 江蘇 南京 210095)

自20世紀(jì)90年代以來, 白斑綜合征病毒給全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。在已報道的研究中, 該病毒可感染并致死多個對蝦種類, 如中國對蝦(Penaeus chinensis)[2-4]、南美白對蝦(Penaeus vannamei)[5]、斑節(jié)對蝦(Penaeus mondom)[6-8]等一些重要對蝦經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種。

脊尾白蝦又稱小白蝦, 是中國特有的經(jīng)濟(jì)蝦類之一[9]。近年來, 由于味道鮮美, 養(yǎng)殖效益較高, 脊尾白蝦的養(yǎng)殖規(guī)模面積迅速擴大。但隨著養(yǎng)殖密度的不斷增大, 其病害問題開始日益凸顯。目前, 對脊尾白蝦的研究報導(dǎo)主要集中在生物學(xué)[10]及繁殖育種學(xué)[11]方面, 而脊尾白蝦疾病的研究工作相對較少, 吳友呂等[12]通過電子顯微鏡的觀察發(fā)現(xiàn)浙江發(fā)病的脊尾白蝦體內(nèi)存在一種桿狀病毒, 雷質(zhì)文[13]等在對WSSV進(jìn)行研究時認(rèn)為脊尾白蝦是WSSV的宿主之一。2010年、2011年江蘇沿海多數(shù)地方海水養(yǎng)殖中發(fā)生了脊尾白蝦大規(guī)模死亡的現(xiàn)象, 本課題組通過對大量發(fā)病樣品進(jìn)行病毒檢測分析發(fā)現(xiàn), 發(fā)病樣品中白斑綜合征病毒感染率為100%。另外, 通過感染試驗, 進(jìn)一步研究了白斑綜合征病毒對脊尾白蝦的感染特性和致病性。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病蝦的分析

發(fā)病脊尾白蝦取自江蘇南通東凌養(yǎng)殖場、江蘇大豐裕華灘養(yǎng)殖場等。取10只發(fā)病蝦的鰓絲、肝 胰臟、肌肉、腸道等組織器官, 提取DNA或RNA模板后進(jìn)行WSSV、桃拉病毒(TSV)及傳染性皮下及造血組織壞死病毒(IHHNV)的檢測, 采用的引物序列見表1。

表1 對蝦病毒檢測引物及檢測結(jié)果 Tab. 1 The primers for testing virus in shrimp and the test results

1.2 WSSV對脊尾白蝦的感染試驗

1.2.1 實驗條件

實驗在江蘇省海水增養(yǎng)殖技術(shù)及種苗中心進(jìn)行。實驗用海水為天然海水, 海水相對比重為1.021, pH為 7.8～8.3, 海水經(jīng)沙濾及暗沉淀后備用, 實驗用小水泥池容積為2 m3, 24 h充氣, 每天換水1次, 換水量為80%。

1.2.2 實驗用蝦

發(fā)病蝦: 2011年8月在江蘇南通東凌養(yǎng)殖場發(fā)病池塘采取, 部分病蝦個體現(xiàn)場取其鰓、肝胰臟、腸道等組織器官固定, 部分樣品放干冰帶回實驗室-70℃感染實驗及鑒定備用。

健康蝦: 2011年9月在江蘇省海洋水產(chǎn)研究所繁殖育種基地采取, 選擇體表干凈, 活力強, 體長(5±0.5)cm, 體質(zhì)量(2.3±0.3)g, 肢體健全個體進(jìn)行WSSV、TSV及IHHNV的檢測, 檢測結(jié)果為陰性樣品作為感染實驗用蝦。

1.2.3 人工注射感染

病毒粗提液的制備按謝數(shù)濤[14]等的方法并進(jìn)行部分調(diào)整后對病蝦體內(nèi)WSSV進(jìn)行粗提。取體表發(fā)紅、顯微觀察甲殼帶有白斑且PCR擴增為陽性的瀕死病蝦, 在冰浴下剪碎, 按0.1 g組織加入1 mL TN緩沖液(pH 7.4), 于勻漿器中勻漿, 將勻漿液以3 500 r/min離心15 min, 棄沉淀, 將上清液經(jīng)0.45 μm孔徑濾膜過濾, 過濾后液體即為病毒粗提液。

取健康蝦進(jìn)行試驗分組, 分別為空白組、注射生理鹽水組、注射病毒液組, 各組設(shè)立平行A組和B組, 注射劑量為0.2 mL。每個小水泥池養(yǎng)殖100尾脊尾白蝦進(jìn)行觀察實驗。每天監(jiān)測各組蝦的生理狀態(tài), 并記錄各組死亡個數(shù), 并收集瀕死蝦固定后, 進(jìn)行超微細(xì)胞病理觀察。另外, 每天取對照組、注射生理鹽水組及注射病毒液組5只死亡蝦(未死亡或死亡不足5只時取同樣設(shè)置組補足數(shù)量)進(jìn)行WSSV的病毒檢測, 檢測方法同上。

2 結(jié)果

2.1 脊尾白蝦發(fā)病特征

江蘇南通東凌海水養(yǎng)殖場以及大豐裕華灘海水養(yǎng)殖場于2011年8月和2011年9月分別發(fā)生了脊尾白蝦大量死亡現(xiàn)象。發(fā)病蝦(圖1)表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍, 沿池塘四周慢慢游動; 攝食量減少, 甚至不攝食。蝦體發(fā)紅, 胃腸空虛(圖1-1), 甲殼易于剝落, 甲殼部白斑肉眼觀察不明顯, 對頭胸甲及尾部甲殼顯微觀察可見明顯白斑(圖1-2)。

圖1 發(fā)病脊尾白蝦 Fig.1 The infected shrimp

2.2 發(fā)病蝦WSSV、TSV、IHHNV等相關(guān)病原檢測結(jié)果

應(yīng)用分子生物學(xué)手段對3種常見蝦類病毒進(jìn)行了檢測, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 所有的樣品中, WSSV的檢測率為100%, 而TSV和IHHNV檢出率都為0, 詳細(xì)結(jié)果見表1。在WSSV檢測過程中, 雖然有20%的樣品僅第一對引物檢測為陰性, 但第二對引物檢測表現(xiàn)為陽性, 此類樣品的WSSV檢測結(jié)果仍應(yīng)判為陽性。

2.3 WSSV對脊尾白蝦的致病性

感染實驗進(jìn)行過程中, 注射病毒粗提液組在感染實驗進(jìn)行第2天后就出現(xiàn)攝食量減少, 部分蝦離群在水面上獨游, 游動時失去平衡, 部分蝦長臥池底對外界刺激反應(yīng)減弱。感染實驗第3天, 注射病毒組部分蝦失去攝食行為, 身體發(fā)紅, 游動靠邊, 注射生理鹽水組也有個別死亡。在第4天注射病毒組出現(xiàn)了死亡, 隨后死亡個數(shù)逐漸增加, 死亡高峰出現(xiàn)在第8天, 14 d后注射病毒組感染實驗總累積死亡率達(dá)到68.5%, 死亡個體表現(xiàn)為游動緩慢, 不攝食, 通體微紅, 頭胸甲部在顯微觀察下有白色斑點。

應(yīng)用分子生物學(xué)方法對感染后的發(fā)病個體以及死亡個體都進(jìn)行了檢測, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 所有的發(fā)病及死亡個體蝦都能檢出WSSV。

表2 脊尾白蝦人工感染病毒死亡統(tǒng)計及病毒檢測結(jié)果 Tab. 2 The mortality of artificial infected Exopalaemon carinicauda Holehuis and virus test results

2.4 病毒電鏡觀察

對健康蝦、發(fā)病蝦及感染蝦的鰓、肝胰臟及腸道組織器官細(xì)胞切片觀察發(fā)現(xiàn), 健康蝦的細(xì)胞核形態(tài)正常, 核膜與核孔結(jié)構(gòu)清晰, 線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及微管等器官形態(tài)正常, 未見明顯的病毒粒子和其他病原(圖2-1)。在發(fā)病蝦與感染實驗病蝦的各組織器官的細(xì)胞核出現(xiàn)腫脹, 染色質(zhì)消失(圖2-2); 線粒體變圓, 內(nèi)嵴消失, 甚至出現(xiàn)空泡化等一系列的細(xì)胞病理變化(圖2-2, 2-3)。另外, 在各組織器官的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中都發(fā)現(xiàn)了大量的桿狀病毒, 病毒粒子大小約為(130～170)nm×(305～405)nm; 核衣殼呈子彈形, 一端較細(xì)而一端較粗, 完整病毒粒子由核心、衣殼和囊膜構(gòu)成, 核心與核衣殼結(jié)合緊密, 囊膜為單位單層膜結(jié)構(gòu)(圖2-2, 2-3, 2-4)。

3 討論

3.1 WSSV的致病性

圖2 WSSV感染下引起的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化 Fig. 2 Changes of Exopalaemon carinicauda Holehuis cell ultrastructure induced by WSSV infection

作者通過對發(fā)病蝦及其感染蝦的體表癥狀、細(xì)胞病理、病毒分子生物學(xué)檢測及病毒感染實驗進(jìn)行了WSSV對脊尾白蝦的感染及致病性研究。首先, 體表癥狀表明, 池塘發(fā)病蝦與感染蝦死亡癥狀基本一致。其次, 在感染實驗中, 將病毒粗提液最后通過濾膜過濾, 以避免其他病原因素, 如弧菌[18-19]、寄生 蟲[20]等因素的影響, 結(jié)果顯示, 感染蝦出現(xiàn)了大量的死亡, 14 d累積死亡率達(dá)68.5%, 表明WSSV對脊尾白蝦具有較強的致病性。再次, 對實驗蝦病毒分子 生物學(xué)檢測發(fā)現(xiàn), 發(fā)病蝦及感染蝦WSSV為陽性, TSV及IHHNV未檢出, 由此可以排除其他兩種病毒的可能性。最后, 對發(fā)病蝦、健康蝦及感染蝦的細(xì)胞超微觀察后, 發(fā)現(xiàn)WSSV健康蝦的細(xì)胞形態(tài)正常, 在各組織器官的細(xì)胞質(zhì)中未見WSSV粒子, 而發(fā)病蝦與感染蝦都出現(xiàn)了明顯的病理變化, 且細(xì)胞病理變化相似, 在各組織器官的細(xì)胞質(zhì)中還發(fā)現(xiàn)了大量的成熟或裝配的WSSV粒子。以上實驗結(jié)果符合柯赫氏法則, 作者認(rèn)為, WSSV感染脊尾白蝦并可以導(dǎo)致大規(guī)模的死亡。

3.2 脊尾白蝦感染W(wǎng)SSV的特征與死亡率

WSSV感染甲殼類動物基本都會引起甲殼表皮細(xì)胞、鰓上皮細(xì)胞的組織器官壞死, 進(jìn)而在寄主甲殼部分產(chǎn)生肉眼可見白色斑點, 如中國對蝦[2]、斑節(jié)對蝦[6]及克氏原螯蝦(Cambarus proclarkii)[21]發(fā)病時甲殼帶有的明顯白斑。脊尾白斑感染W(wǎng)SSV死亡時身體發(fā)紅, 甲殼部白色斑點肉眼不可見, 但剝離后在光鏡下可見, 這與斑節(jié)對蝦[7]的死亡特征有些類似, 正因為無明顯白點和體表發(fā)紅, 則很容易與TSV的感染[16]特征相混淆。WSSV對大部分蝦類都是強致病性病毒, 據(jù)相關(guān)流行病學(xué)的研究報道, 該病毒可引起中國對蝦、南美白對蝦及斑節(jié)對蝦等蝦類80%以上的死亡率, 在實驗條件下會更高。在作者的感染實驗中脊尾白蝦死亡率為68.5%, 而在野外自然池塘養(yǎng)殖條件下死亡率僅在30%～40%, 死亡率明顯低于其他經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蝦類。另外, WSSV感染并引起脊尾白蝦的死亡周期與其他蝦類也有所不同。據(jù)WSSV流行病學(xué)研究報道, WSSV引起蝦類的死亡一般在夏末秋初, 因池塘理化因子如溫度[22]、溶解氧[23]、鹽度[24]的劇變及多種病原因子如弧菌與病毒的共同作用毒力加倍下[25], 死亡率達(dá)到高峰。但作者對脊尾白蝦流行病學(xué)調(diào)查后發(fā)現(xiàn), 除夏末秋初的死亡高峰期外, 從春季開始就有零星死亡, 且進(jìn)入秋末冬初氣溫較低時, 部分養(yǎng)殖池塘仍出現(xiàn)較高的死亡率。分析原因, 作者認(rèn)為, 這與脊尾白蝦的苗種獲取方式有關(guān), 脊尾白蝦為抱卵孵化蝦類, 目前苗種以種蝦留池自繁的方式為主, 因此初步推斷WSSV長期感染是因為病毒的垂直傳播, 其傳播機制正在研究中。

[1] Lightner D V, Revdman R M. Shrimp diseases and current diagnostic methods [J]. Aquaculture, 1998, 164: 201-220.

[2] Lo C F, Kou G H. Virus-associated white spot syndrome of syndrome in Taiwan: a review [J]. Fish Pathol, 1998, 33: 365-371.

[3] Chou H Y, Huang C Y, Wang C H, et al. Pathology of a baculovirus infection causing white spot syndrome in cultured penaeid shrimp in Taiwan [J]. Disease of Aquatic Organisms, 1995, 23: 165-173.

[4] 倢黃 , 宋曉玲, 于佳, 等．桿狀病毒性的皮下及造血組織壞死對蝦暴發(fā)性流行病的病原和病理學(xué)[J]． 海洋水產(chǎn)研究, 1995, 16(1): 1- 10．

[5] Boonyaratpalin S, Supamattaya K, Kasornchandra J, et al. Non-occluded baculo-like virus, the causative agent of yellow head disease in the black tiger shrimp [J]. Fish Pathol, 1993, 28(3): 103-109.

[6] Magbanua F O, Natividad K T, Migo V P, et al. White spot syndrome virus (WSSV) in culturedPenaeus mondomin the Philippines[J]. Disease of Aquatic Organisms, 2000, 42: 77-82.

[7] 翁少萍, 何建國, 鐘慰, 等．斑節(jié)對蝦白斑綜合癥桿狀病毒致病性及組織細(xì)胞特異性研究[J]．中山大學(xué)學(xué)報論叢, 1996, 增刊: 16-22.

[8] 張呂平, 胡超群, 任春華．對蝦白斑桿狀病毒(WSBV)對斑節(jié)對蝦血液病理學(xué)研究[J]．熱帶海洋, 2000, 19(3): 1-8.

[9] 李明云．池養(yǎng)脊尾白蝦的繁殖、生長及其最大持續(xù)輪捕量的初步探討[J]．水產(chǎn)學(xué)報, 1994,18(2):85-92．

[10] 王興強, 閻斌倫, 甡馬 , 等．脊尾白蝦生物學(xué)及養(yǎng)殖生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展[J]．齊魯漁業(yè), 2005, 22(8):21-23.

[11] 徐加濤, 徐國成, 于斌, 等．脊尾白蝦繁殖生物學(xué)及人工育苗生產(chǎn)技術(shù)[J]．中國水產(chǎn), 2007, 4:52-55．

[12] 吳友呂, 陳全震．脊尾白蝦桿狀病毒病研究[J]．水產(chǎn)科技情報, 1995, 22(1):8-13.

[13] 雷質(zhì)文, 倢黃 , 史成銀, 等．白斑綜合癥病毒(WSSV)的宿主調(diào)查[J]．海洋與湖沼, 2002, 33(3): 250-258.

[14] 謝數(shù)濤, 何建國, 閆慶生, 等．對蝦白斑癥病毒的分離純化及形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察[J].中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2000, 39(4): 90-93.

[15] Lo C F, Hsu H C, Tsai M F, et al. Specific genomic DNA fragment analysis of different geographical clinical samples of shrimp white spot syndrome virus[J]. DIS Aquat Org, 1999,35: 175-185.

[16] Nunan L M, Poulos B T, Lightner D V. Reverse transcription polymerase chain (RT-PCR) used for the detection of Taura Syndrome virus(TSV) in experimentally infected shrimp[J]. Dis Aquat Org, 1998, 34: 87-91.

[17] Nunan L M, Poulos B T, Lightner D V. Use of polymerase chain reaction (PCR) for the detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus (IHHNV) in penaeid shrimp [J]. Mar Biotechnol, 2000,2: 319-328.

[18] 陳強, 鄢慶枇, 甡馬 ．溶藻弧菌致病性研究進(jìn)展[J].海洋科學(xué), 2006, 30(8):83-89.

[19] Alapide-Tendencia E V, Dureza L A. Isolation ofVibriospp.frompenaeus monodon(fabricius) with red disease syndrome[J]. Aquaculture, 1997, 154: 107-114.

[20] 許文軍, 謝建軍, 施慧, 等．池塘養(yǎng)殖脊尾白蝦(Exopalaemon carinicauda)感染血卵渦鞭蟲的研究[J]. 海洋與湖沼,2010, 3(41): 396-402.

[21] 丁正峰, 薛輝, 夏愛軍, 等．白斑綜合征病毒在養(yǎng)殖克氏原螯蝦中感染流行研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2008, 31(4): 129-133.

[22] Sung H. Characterisation of monoclonal antibodies to haemocyte subpopulations of tiger shrimp (Penaeus monodon): immunochemical differentiation of three major haemocyte types[J]. Fish & Shellfish Immunology, 1999, 9(3): 167-179.

[23] 劉發(fā)義, 趙鴻儒. 對蝦養(yǎng)殖池中若干水質(zhì)問題探討[J]．海洋科學(xué), 1991, 15(3): 6-8.

[24] Hauton C, Hawkins L E, Hutchinson S. The effects of salinity on the interaction between a pathogen (Listonella anguillarum) and components of a host (Ostrea edulis) immune system[J]. Comp Biochem Physiol, 2000, 127: 203-212.

[25] Lee K K, Yang T I, Liu P C, et al. Dual chanllenges of infectious pancreatic necrosis virus and Vibrio carchariae in the grouper,Epinephelussp.[J]. Virus Research, 1999, 66: 131-134.