陳 明，徐幸蓮，周光宏，湯曉艷*，袁 飛，陳愛(ài)亮

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；3.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123)

沙門氏菌(Salmonella)是對(duì)人類和動(dòng)物健康危害嚴(yán)重的一類致病菌，在美國(guó)，沙門氏菌已被實(shí)驗(yàn)室證實(shí)是最重要的食源性致病菌，而在歐洲，沙門氏菌也成為最主要的致病菌之一[1-3]。在引起沙門氏菌中毒的食品中，以動(dòng)物性食品污染最為嚴(yán)重[4-5]。感染了沙門氏菌的患者輕則引起腹瀉、惡心，重則導(dǎo)致傷寒、敗血性休克，甚至死亡[6-8]。引起人類疾病的沙門氏菌血清型主要為腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌[9-13]。本研究選擇含有屬特異性共同抗原表位的鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白基因fliC，利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得沙門氏菌鞭毛融合蛋白，純化后以此融合蛋白作為抗原制備多克隆抗體，為進(jìn)一步研究沙門氏菌免疫學(xué)檢測(cè)方法和試劑盒的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

鼠傷寒沙門氏菌菌株S. typhimurium(從雞肉中分離) 中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院；質(zhì)粒載體pET28a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保存；表達(dá)菌株BL21(DE3)pLysS 天根生化科技(北京)有限公司。

BALB/c小鼠，6～8周齡，由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)院動(dòng)物中心提供。

1.1.2 試劑

DNA限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP 美國(guó)NEB公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 天根生化科技(北京)有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、弗氏佐劑及弗氏不完全佐劑 美國(guó)Sigma公司；Ni-NTA樹脂 德國(guó)Qiagen公司；PVDF膜和顯色試劑 生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因fliC引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)PCR引物設(shè)計(jì)的原則，利用Primer Premier 5.0軟件對(duì)經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)篩選的沙門氏菌屬內(nèi)同源性較高的鼠傷寒沙門氏菌目的基因fliC(AY353377.1)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，上游引物(FLICF)：5’-GGCAGCCATATGGCACAAGTC ATTAATACAAACAGCCTGT-3’，劃線處為NdeⅠ酶切位點(diǎn)，下游引物(FLICR)：5’-GTGGTGCTCGAGACGCA GTAAAGAGAGGACGTTTTGCGGAA-3’，劃線部分為XhoⅠ限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，以上引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 總DNA的提取及鞭毛蛋白基因的擴(kuò)增

利用天根生化科技(北京)有限公司的細(xì)菌基因組提取試劑盒從新鮮的沙門氏菌菌液中提取沙門氏菌基因組，并以此為模板進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序：94℃、5min；94℃、1min，60℃、45s，72℃、90s，32個(gè)循環(huán)；72℃、7min。采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 融合表達(dá)載體的構(gòu)建與測(cè)序

用N d e Ⅰ和X h o Ⅰ雙酶切P C R 產(chǎn)物和表達(dá)載體pET28a(+)，將膠回收純化的載體酶切產(chǎn)物和PCR酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒pET28a-fliC，轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)pLysS，涂于含20μg/mL卡那霉素的LB平板上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。取陽(yáng)性克隆進(jìn)行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.2.4 表達(dá)載體在大腸桿菌中的表達(dá)及可溶性分析

挑取含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆菌株，過(guò)夜培養(yǎng)，次日按1：100轉(zhuǎn)種至100mL含卡那霉素抗性的LB培養(yǎng)液中，37℃搖床培養(yǎng)3h至A600nm達(dá)0.6～0.8，加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為1mmol/L，繼續(xù)振搖6h。培養(yǎng)結(jié)束后12000r/min離心5min，收集菌體沉淀。將菌體沉淀重懸于細(xì)菌裂解液(50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH8.0)中，超聲波破碎后12000r/min離心10min，收集上清液和沉淀。分別取少量上清液和沉淀進(jìn)行SDSPAGE電泳分析。

1.2.5 親和層析純化融合蛋白

根據(jù)1.2.4節(jié)的步驟將含重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌株擴(kuò)增培養(yǎng)至500mL，誘導(dǎo)表達(dá)后，離心收集沉淀，將其用細(xì)菌裂解液溶解后進(jìn)行超聲破碎，離心取上清，根據(jù)Ni-NTA瓊脂糖樹脂操作說(shuō)明對(duì)上清液進(jìn)行純化。具體步驟參考Qiagen公司Ni-NTA樹脂使用說(shuō)明。經(jīng)純化的蛋白用SDS-PAGE進(jìn)行電泳分析。

1.2.6 Western-blotting鑒定

將純化產(chǎn)物經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，在含5g/100mL脫脂奶的PBST中4℃封閉過(guò)夜，以鼠抗His標(biāo)簽單抗為第一抗體，室溫結(jié)合1h，TBST洗3次，每次10min，再加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，室溫結(jié)合1h，TBST洗3次，每次10min，用 ECL顯色試劑對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行顯色鑒定。

1.2.7 FliC融合蛋白多克隆抗體的制備

選3只體質(zhì)量為6～8周齡的健康雌性和雄性BALB/c小鼠，對(duì)小鼠進(jìn)行多點(diǎn)皮下注射，50μg/只。每隔2周加強(qiáng)免疫1次，此時(shí)免疫原改用弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化。從第2次加強(qiáng)免疫后開始監(jiān)測(cè)血清，于第3次加強(qiáng)免疫后7d尾部靜脈采血，用間接ELISA檢測(cè)抗血清。待血清效價(jià)穩(wěn)定后，斷頭采血，分離血清，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.8 間接ELISA法測(cè)定抗血清效價(jià)

用包被緩沖液(pH9.6、0.05mol/L碳酸鹽緩沖液)稀釋的抗原包被酶標(biāo)板，4℃過(guò)夜；以含3g/100mL脫脂奶粉的封閉液37℃封閉1h；依次加入倍比(100、1000、10000、100000)稀釋的抗血清，37℃溫育30min，洗滌，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和陰性血清對(duì)照；加入稀釋(1：4000)的羊抗鼠IgG-HRP，37℃溫育2h，最后以TMB為底物顯色置室溫暗室處10min最后加50μL終止液(2mol/L H2SO4)，用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD450nm值。

1.2.9 抗血清特異性的鑒定

以10種沙門氏菌(含目標(biāo)菌)和10種非沙門氏菌屬的常見食物中毒菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等)為包被原包被酶標(biāo)板，同時(shí)做陰性對(duì)照，用間接ELISA法測(cè)定各孔的OD450nm值，具體操作步驟同1.2.8節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖 1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Analysis of PCR products by 1% agarose gel electrophoresis

本實(shí)驗(yàn)用所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果見圖1，可以看出1條特異性的DNA條帶，大小與預(yù)期值1509bp大小相吻合。

2.2 重組質(zhì)粒pET28a-fliC酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證

圖 2 重組表達(dá)載體的雙酶切鑒定結(jié)果Fig.2 Identification of recombinant expression vectors by double enzyme digestion

用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒進(jìn)行NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切，經(jīng)0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)共出現(xiàn)2條帶，分別與載體和預(yù)期fliC目的基因片段的大小相符(圖2)，提示重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒pET28a-fliC的fliC基因經(jīng)測(cè)序，全長(zhǎng)為1509bp，結(jié)合載體序列進(jìn)行分析，確定其開放讀碼框架正確，無(wú)移碼和突變現(xiàn)象，進(jìn)一步證明載體構(gòu)建成功。

2.3 重組質(zhì)粒的表達(dá)和可溶性分析

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)pLysS中，加入誘導(dǎo)劑IPTG，參考文獻(xiàn)[14]的誘導(dǎo)時(shí)間誘導(dǎo)6h，收集細(xì)胞裂解后進(jìn)行SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，在40.0～60.0kD間，誘導(dǎo)組菌體蛋白較對(duì)照組出現(xiàn)明顯誘導(dǎo)條帶(圖3)，其分子質(zhì)量大小與預(yù)期(54.6kD)基本相符。可溶性分析結(jié)果表明，融合蛋白大部分存在于裂解液上清液中(圖4)。

圖 3 融合蛋白表達(dá)的SDS-PAGE 分析Fig.3 SDS-PAGE analysis for the expression of fusion protein

圖 4 重組蛋白表達(dá)形式的鑒定Fig.4 Identification of the recombinant proteins

2.4 重組蛋白的純化及Western-blotting鑒定

陽(yáng)性克隆菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，經(jīng)超聲裂解，收集超聲后的上清液，經(jīng)Ni-NTA樹脂純化，收集洗脫液用SDSPAGE分析，純度較高(圖5)。Western-blotting結(jié)果(圖6)顯示，純化后所得蛋白可被His-Tag抗體識(shí)別，說(shuō)明表達(dá)的重組蛋白帶有His-Tag，空質(zhì)粒對(duì)照并未出現(xiàn)誘導(dǎo)條帶。

圖 5 純化的重組蛋白的SDS-PAGE分析 Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purified proteins

圖 6 純化的重組蛋白的Western-blotting分析Fig.6 Western-blotting analysis of the purified proteins

2.5 血清效價(jià)的測(cè)定結(jié)果

小鼠經(jīng)4次免疫后，尾靜脈取血檢測(cè)，用間接ELISA進(jìn)行效價(jià)測(cè)定，根據(jù)P/N≥2.1，陽(yáng)性血清的最大稀釋比例為抗血清的效價(jià)，結(jié)果表明3只小鼠血清抗體效價(jià)達(dá)到1：32000，其中第2只小鼠的抗血清效價(jià)達(dá)1：128000，具體結(jié)果見表1。

表 1 間接ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)結(jié)果 Table 1 Results obtained for the assay of titer by indirect ELISA

2.6 抗體特異性檢測(cè)結(jié)果

表 2 間接ELISA檢測(cè)抗體特異性結(jié)果Table 2 Results obtained for the analysis of specificity by indirect ELISA

由表2可知，制備的抗血清與6種非沙門氏菌屬的常見食品中致病菌無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)，與10種沙門氏菌中的6株有陽(yáng)性反應(yīng)，這6株菌分別為：鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、紐波特沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌和阿伯丁沙門氏菌。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)將PCR得到的目的片段測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其編碼蛋白序列，發(fā)現(xiàn)了TDKN GKSIDGGY這一肽段，通過(guò)相關(guān)軟件的比對(duì)發(fā)現(xiàn)其與沙門氏菌屬特異性共同抗原表位TDNNGKTIDGGL位點(diǎn)具有同源性，這與文獻(xiàn)[15]報(bào)道的一致。原核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有成本低、周期短、操作簡(jiǎn)便等許多優(yōu)點(diǎn),而pET系統(tǒng)在E. coli 中克隆表達(dá)重組蛋白具有很大的優(yōu)勢(shì)，主要表現(xiàn)為表達(dá)效率高，可在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)出大量的目的蛋白。本研究利用pET28a(+)表達(dá)了C端和N端融合了6×His的沙門氏菌鞭毛蛋白基因fliC，并利用Ni-NTA親和純化方法得到了較純的目的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE和Western-blotting鑒定證明，該蛋白的大小和預(yù)計(jì)大小相符。

本研究采用His-Tag標(biāo)記的質(zhì)粒pET28a(+)載體進(jìn)行表達(dá)，His-Tag分子質(zhì)量小，免疫原性小，不影響目的蛋白的活性，且方便后續(xù)的純化和鑒定[16]。表達(dá)的His-Tag融合蛋白無(wú)論是可溶性的或者包涵體形式都可以用Ni-NTA樹脂去純化，Ni-NTA樹脂具有特異性好、流速快、顆粒度均勻、粒徑小、螯合鎳穩(wěn)定、物理和化學(xué)穩(wěn)定性好、批次重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)表達(dá)的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，大部分以可溶性形式存在。這與饒星等[14]在相關(guān)研究中表達(dá)出的以包涵體形式存在的鞭毛蛋白不同，可溶性蛋白的純化過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單,無(wú)需像包涵體形式蛋白純化那樣經(jīng)歷變性、復(fù)性等復(fù)雜過(guò)程[17]。

要制備高效價(jià)、高特異性的抗體必須有理想的免疫原、合適的免疫動(dòng)物和切實(shí)可行的免疫方案。蛋白質(zhì)是良好的抗原，前期實(shí)驗(yàn)獲得的鞭毛融合蛋白經(jīng)過(guò)親和層析純化，可作為免疫原免疫小鼠制備抗血清。

佐劑是一種非特異性的免疫增強(qiáng)劑，當(dāng)其與抗原一起注入機(jī)體時(shí)，可增強(qiáng)機(jī)體應(yīng)答反應(yīng)。佐劑的作用原理為：1)改變抗原的物理性狀，增加抗原在體內(nèi)儲(chǔ)留時(shí)間；2)通過(guò)刺激單核-巨噬細(xì)胞，增加APC對(duì)抗原的處理和提呈能力；3)誘發(fā)抗原注射部位及其局部淋巴結(jié)的炎癥反應(yīng)，有利于刺激免疫細(xì)胞的增殖作用；4)刺激淋巴細(xì)胞的增殖分化，從而增強(qiáng)和擴(kuò)大免疫應(yīng)答的能力[18-19]。本實(shí)驗(yàn)中用于乳化抗原的佐劑即為弗氏佐劑，在初次免疫時(shí)，使用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫時(shí)使用弗氏不完全佐劑，以利于抗原持續(xù)刺激動(dòng)物機(jī)體，產(chǎn)生高濃度的特異性IgG型免疫球蛋白。

免疫間隔時(shí)間是影響免疫效果的重要因素。第一次免疫后，因動(dòng)物機(jī)體正處于抗原識(shí)別和特異性B細(xì)胞增殖階段，若很快進(jìn)行第二次抗原注入，極易引起免疫抑制。所以一般以間隔10～20d為宜。第二次免疫注射后，每次加強(qiáng)免疫的間隔時(shí)間一般為7～10d，不能太長(zhǎng)，以防刺激變?nèi)酰贵w效價(jià)不高。加強(qiáng)免疫兩次后就可進(jìn)行試血，如抗血清效價(jià)符合要求，應(yīng)在末次免疫后5～7d及時(shí)采血，否則抗體效價(jià)將會(huì)下降[20]。本實(shí)驗(yàn)初次免疫小鼠后2周，進(jìn)行加強(qiáng)免疫，然后每隔2周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，在第四次加強(qiáng)免疫后的第7天取血用間接ELISA測(cè)定效價(jià)。結(jié)果表明用純化的鞭毛融合蛋白免疫小鼠后得到的抗血清，效價(jià)可達(dá)1：32000以上，為進(jìn)一步建立沙門氏菌屬的免疫學(xué)檢測(cè)方法提供了前期參考。

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