田 甜，魏延玲，何立超，阮貴萍，張迎陽，章建浩*

(國家肉品質(zhì)量安全控制工程技術(shù)研究中心，教育部肉品加工與質(zhì)量控制重點實驗室，農(nóng)業(yè)部農(nóng)畜產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點開放實驗室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

氨肽酶廣泛存在于動物、植物和微生物體內(nèi)，發(fā)揮著從蛋白質(zhì)或多肽鏈的N末端切割酰胺鍵逐一釋放氨基酸的作用。氨肽酶在火腿的加工過程中水解寡肽(特別是三肽和四肽)釋放游離氨基酸，游離氨基酸再通過Strecker降解和美拉德反應(yīng)產(chǎn)生小分子化合物，形成產(chǎn)品的特征風(fēng)味[1]。丙氨酰氨肽酶(AAP)廣泛存在于各類動物骨骼肌中，其底物范圍廣，特別是水解苯丙氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸和亮氨酸形成的酰胺鍵，由于水解丙氨酸的速率最快，故稱為丙氨酰氨肽酶[2]。

火雞原產(chǎn)于墨西哥，是世界上最大的肉用禽類；與肉雞相比，火雞的肉質(zhì)鮮嫩可口，蛋白質(zhì)含量高，脂肪和膽固醇含量低，并富含豐富的B族維生素和VE，被美國營養(yǎng)學(xué)家推崇為“超級營養(yǎng)食物”[3]。目前，我國火雞產(chǎn)業(yè)處于“易產(chǎn)難銷”的狀態(tài)，市面上的火雞產(chǎn)品種類少、價格高，不利于消費；但隨著人民生活水平的提高、健康飲食的不斷關(guān)注以及食品種類多元化的發(fā)展，火雞可能將成為人們餐桌上優(yōu)質(zhì)的肉源性食物的首選。國際上對于火雞的研究多集中在火雞加工[4]、火雞鮮肉及產(chǎn)品的保鮮[5-6]、脂質(zhì)氧化及抗氧化[7-9]、膽固醇氧化[10]及類PSE肉[11-12]等方面，而火雞肌肉蛋白質(zhì)水解及相關(guān)蛋白酶的酶學(xué)特性及作用機(jī)理還缺乏系統(tǒng)研究。本文以火雞肌肉為原料，研究其中的重要氨肽酶AAP酶學(xué)特性及其鹽分和水解產(chǎn)物等對其酶活力的影響，探索AAP等氨肽酶在火雞加工過程中對蛋白質(zhì)水解及風(fēng)味品質(zhì)形成的作用機(jī)理，為調(diào)控及提高產(chǎn)品風(fēng)味品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍火雞下腿60只由南京雨潤集團(tuán)提供，使用前于4～10℃條件下自然解凍。

丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Ala-AMC)、7-氨基-4-甲基香豆素(AMC) 瑞士Bachem公司；β-巰基乙醇(BC級) 美國Amresco公司；丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸(BR級) 上?？笊锛夹g(shù)公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

M2e多功能酶標(biāo)儀 美國MD公司；96孔黑色酶標(biāo)板 美國Costar公司；722s可見分光光度計 上海精密儀器有限公司；TGL 20M-Ⅱ冷凍高速離心機(jī) 湖南省凱達(dá)實業(yè)發(fā)展有限公司；T25 digital高速分散機(jī) 德國IKA集團(tuán)。

1.3 方法

1.3.1 丙氨酰氨肽酶活力測定

1.3.1.1 酶的提取

丙氨酰氨肽酶的提取參考Toldrá[13]、Rosell[14]等的方法，并進(jìn)行了適當(dāng)?shù)男薷?。具體方法如下：剔除火雞樣品中可見的脂肪和結(jié)締組織，剁碎后準(zhǔn)確稱取10g左右(精確到0.001g)，加入50mL酶提取緩沖液(50mmol/L PBS緩沖液，pH7.5，含5mmol/L EDTA)，在冰浴條件下用高速分散機(jī)勻漿3次(15000～17000r/min，每次10s，間隔20s)，10000×g離心20min，上清液經(jīng)4層紗布過濾即得粗酶液。粗酶液再經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為45%～65%的硫酸銨進(jìn)行分級分離，沉淀用最少量的蒸餾水溶解后用蒸餾水透析。

1.3.1.2 酶活力測定

丙氨酰氨肽酶活力的測定參考Toldrá等[15]的方法，并進(jìn)行了適當(dāng)?shù)男薷?。具體方法如下：酶反應(yīng)緩沖液為50mmol/L的Tris-HCl(pH7.5)含體積分?jǐn)?shù)0.1% β-巰基乙醇(記為緩沖液A)，向270μL緩沖液A中加入30μL酶液，37℃條件下預(yù)熱10～20min，加入3μL 25mmol/L熒光底物Ala-AMC反應(yīng)20min后立刻加入600μL無水乙醇終止反應(yīng)。產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度用多功能酶標(biāo)儀于激發(fā)波長(λex)380nm、發(fā)射波長(λem)440nm處測定。對照組在加入底物后立刻加入600μL無水乙醇終止反應(yīng)。

酶活力(U)單位定義為：每小時釋放1μmol AMC所需的酶量。相對酶活力為：各處理組的酶活力相對于最高酶活力的百分比(最高酶活力記為100%)。

1.3.1.3 AMC標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用無水乙醇溶解AMC，配制5mmol/L的AMC標(biāo)準(zhǔn)液。取21支試管分7組(每組3支平行樣)編號。向7組試管中分別加入0、5、10、15、20、25、30μL的AMC標(biāo)準(zhǔn)液，再加入緩沖液A至試管中溶液體積為300μL?；靹蚝蠓湃?7℃水浴中保溫20min后加入600μL無水乙醇。產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度用多功能酶標(biāo)儀于λex為380nm、λem為440nm處測定。對照AMC標(biāo)準(zhǔn)曲線計算酶反應(yīng)產(chǎn)生的AMC濃度，進(jìn)而計算酶活力。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量的測定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250比色法[16]。

1.3.3 最適溫度的測定

在反應(yīng)體系不變的情況下，分別在0、6、25、40、50、60、70、80℃條件下恒溫反應(yīng)20min，然后測定各組酶活力。

1.3.4 最適pH值的測定

在其他測定條件不變的情況下，酶反應(yīng)最適pH值的測定分別在以下緩沖液(濃度均為50mmol/L)中進(jìn)行：醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH3.0～5.0)、磷酸緩沖液(pH5.5～7.0)、Tris-HCl緩沖液(pH7.5～10.0)。

1.3.5 NaCl濃度對AAP活力影響的測定

向緩沖液A中加入NaCl至終濃度為800mmol/L，將其進(jìn)行稀釋，配制NaCl濃度梯度為200～800mmol/L的緩沖液作為酶反應(yīng)液。在其他條件不變的情況下，測定不同NaCl濃度對AAP活力的影響。

1.3.6 不同氨基酸對酶活力影響的測定

參考Toldrá等[15]的方法，用緩沖液A分別配制濃度為100mmol/L的丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸和苯丙氨酸溶液，調(diào)節(jié)pH值至7.5。然后用緩沖液A將各氨基酸溶液濃度稀釋到6.2、12.5、25.0、50.0mmol/L。在其他條件不變的情況下，測定酶活力。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 17.0進(jìn)行回歸分析，擬合出各游離氨基酸對酶活力的作用曲線，得回歸方程；利用SAS軟件進(jìn)行方差分析，分析NaCl濃度對AAP影響的差異性(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 火雞腿肉中AAP的純化結(jié)果

表 1 火雞腿肉中AAP的純化結(jié)果Table 1 Purification of AAP from turkey leg muscle

由表1可知，經(jīng)過45%～65%的硫酸銨鹽析后，酶的總蛋白和總活力均降低，而比活力和酶的純度均提高了1.5倍，酶活回收率為40.6%。火雞腿肉中AAP酶總活力137.0U，略低于Toldrá等[13]報道的豬腿肉中的AAP酶總活力，這可能與AAP的來源及酶反應(yīng)緩沖體系的不同有關(guān)。

2.2 溫度對AAP活力的影響

圖 1 溫度對AAP相對酶活力的影響Fig.1 Effect of temperature on AAP activity

如圖1所示，AAP相對酶活力隨著溫度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢；AAP相對酶活力在37～39℃之間達(dá)到最大值；當(dāng)溫度低于6℃或高于60℃時，AAP幾乎沒有活力。說明當(dāng)酶反應(yīng)溫度控制在37～39℃之間時，酶處于最適反應(yīng)條件能最大地釋放酶活。牛肉中AAP的最適溫度為37℃，但在低溫條件下(6℃以下)仍能保持較高的活力[17]；不同部位的氨肽酶的最適溫度不同，雞腸道氨肽酶[18]的最適溫度在40～50℃之間，高于火雞肌肉中氨肽酶的最適溫度，這可能與腸道溫度比肌肉溫度高有關(guān)，而氨肽酶的最適溫度可能接近于所處環(huán)境的溫度。

2.3 pH值對AAP活力的影響

圖 2 pH值對AAP相對酶活力的影響Fig.2 Effect of pH on AAP activity

如圖2所示，AAP相對酶活力隨著pH值的升高呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢；AAP相對酶活力在pH6.8～7.5之間達(dá)到最大值；當(dāng)pH值小于5.0或大于10.3時，AAP幾乎沒有活力。這一結(jié)果驗證了AAP是一種中性氨肽酶。不同來源的AAP的最適pH值不同，Nishimura等[19]從雞肉中提取的AAP卻表現(xiàn)出弱酸性的最適pH值為6.5左右，Ye Xiujuan等[17]從牛肉中提取的AAP表現(xiàn)出弱堿性的最適pH值為8.0左右。

2.4 NaCl濃度對AAP活力的影響

如圖3所示，鹽分對丙氨酰氨肽酶活力有一定的抑制作用，但抑制作用較弱。NaCl濃度低于200mmol/L時，它對AAP的抑制作用不顯著(P＞0.05)；鹽濃度在200～400mmol/L之間時，隨著鹽濃度增加，AAP相對酶活力顯著降低；隨著鹽濃度繼續(xù)增加，AAP相對酶活力變化不顯著(P＞0.05)，800mmol/L的NaCl可以抑制10%的AAP相對酶活力。NaCl對豬骨骼肌中的丙氨酰氨肽酶同樣具有抑制作用，且隨著NaCl濃度的增加，酶活力逐漸降低，但NaCl的抑制作用較強(qiáng)，800mmol/L的NaCl使相對酶活力降低了近60%[20]。這可能與酶反應(yīng)體系的差別有關(guān)，包括緩沖液、pH值及底物濃度。

圖 3 NaCl對AAP相對酶活力的影響Fig.3 Effect of NaCl on AAP activity

2.5 蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物氨基酸對AAP活力的抑制作用

以氨基酸濃度為橫坐標(biāo)，AAP的相對酶活力為縱坐標(biāo)，將賴氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)和亮氨酸(Leu)對AAP活力的影響進(jìn)行回歸分析。將AAP相對酶活力抑制率為50%時各種游離氨基酸的濃度記為IC50，用于比較各游離氨基酸對AAP活力抑制作用的強(qiáng)弱。

2.5.1 Lys對AAP活力的影響

圖 4 賴氨酸對AAP相對酶活力的作用曲線Fig.4 Function curve of AAP activity by lysine

如圖4所示，Lys對AAP相對酶活力的影響的回歸方程為y = e4.511―0.016x，該回歸模型顯著(P＜0.01)，擬合度較高(R2=0.99)。AAP相對酶活力隨著Lys濃度的增加呈下降趨勢，Lys濃度每增加10mmol/L，AAP相對酶活力降低約15%；當(dāng)Lys濃度為100mmol/L時，AAP僅有18.4%的殘余相對酶活力；Lys對AAP相對酶活力的IC50為37.4mmol/L。

2.5.2 Met對AAP活力的影響

如圖5所示，Met對AAP相對酶活力影響的回歸方程為y = e4.634―0.008x。此回歸模型顯著(P＜0.01)，擬合度較高(R2=0.98)。AAP相對酶活力隨著Met濃度的增加呈下降趨勢，Met濃度每增加10mmol/L，AAP相對酶活力降低約7%，Met對AAP相對酶活力的抑制作用比Lys的抑制作用弱；Met對AAP相對酶活力的IC50為90.2mmol/L。

圖5 甲硫氨酸對AAP相對酶活力的作用曲線Fig.5 Function curve of AAP activity by methionine

2.5.3 Leu對AAP活力的影響

圖 6 亮氨酸對AAP活力的作用曲線Fig.6 Function curve of AAP activity by leucine

如圖6所示，Leu對AAP相對酶活力影響的回歸方程為y = e4.560―0.011x。回歸模型顯著(P＜0.01)，擬合度較高(R2=0.98)。由方程可知AAP相對酶活力隨著Leu濃度的增加呈下降趨勢，Leu濃度每增加10mmol/L，AAP相對酶活力降低約11%，由此可見，Leu對AAP相對酶活力的抑制作用強(qiáng)弱介于Met和Lys之間；當(dāng)AAP相對酶活力抑制率為50%時，Leu濃度為58.9mmol/L。

2.5.4 苯丙氨酸(Phe)對AAP活力的影響

圖 7 苯丙氨酸對AAP活力的作用曲線Fig.7 Function curve of AAP activity by phenylalanine

由圖7可知，Phe對AAP相對酶活力抑制作用較強(qiáng)，Phe濃度在0～25mmol/L之間時，隨著其濃度的增加AAP相對酶活力波動下降；Phe濃度達(dá)到25mmol/L時，AAP相對酶活力降低了67%；而當(dāng)Phe濃度大于25mmol/L時，AAP相對酶活力變化不顯著；當(dāng)AAP相對酶活力為50%時，Phe濃度小于20mmol/L。

2.5.5 Ala對AAP活力的影響

圖 8 丙氨酸對AAP活力的作用曲線Fig.8 Function curve of AAP activity by alanine

由圖8可知，Ala對AAP幾乎沒有抑制作用；當(dāng)Ala濃度為100mmol/L時，AAP仍有98.7%的相對酶活力；IC50大于100mmol/L。

綜上所述，AAP活力被產(chǎn)物氨基酸廣泛抑制，AAP優(yōu)先水解寡肽的N端丙氨酸，而丙氨酸的抑制作用反而最弱，這與Toldrá等[15]研究結(jié)果一致。IC50值越小，表明該氨基酸對AAP的抑制作用越強(qiáng)。由各氨基酸對AAP活力的IC50值可以看出：苯丙氨酸對AAP活力的抑制作用最強(qiáng)，其次是賴氨酸、亮氨酸和甲硫氨酸。Toldrá等[14]研究了游離氨基酸對豬和人骨骼肌中AAP抑制作用發(fā)現(xiàn)，2種來源的AAP都被游離氨基酸廣泛抑制，且起抑制作用的氨基酸范圍大致相同。起抑制作用的氨基酸均為疏水性氨基酸且支鏈氨基酸的作用更強(qiáng)。各產(chǎn)物氨基酸對人骨骼肌中AAP的抑制強(qiáng)弱為Leu＞Phe＞Met＞Lys＞Ala，而對豬骨骼肌中AAP的抑制強(qiáng)弱為Phe＞Leu＞Lys＞Met＞Ala。對比發(fā)現(xiàn)，Ala都是最弱的抑制劑，各產(chǎn)物氨基酸對火雞肉與豬肉中的AAP的抑制強(qiáng)弱順序更接近，這可能與不同來源的AAP的基因組成有關(guān)。游離氨基酸對調(diào)控細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換(蛋白質(zhì)降解與合成的動態(tài)平衡)的過程具有重要作用，氨肽酶水降解寡肽產(chǎn)生游離氨基酸，游離氨基酸反過來又能抑制氨肽酶的降解作用，這種反饋抑制機(jī)制或許是操控整個蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換過程的潛在點。

3 結(jié) 論

丙氨酰氨肽酶是火雞肉中一種重要的蛋白質(zhì)水解酶，溫度和pH值均能顯著影響AAP活力，37～39℃、pH6.8～7.5時AAP活力最高，而鹽分對AAP活力只有較弱的抑制作用；AAP的產(chǎn)物氨基酸可抑制其水解活性，但主要產(chǎn)物Ala對其抑制作用最弱，這種反饋機(jī)制通過氨基酸的積累會自動抑制AAP活力。因此，通過調(diào)節(jié)火雞加工過程中的溫度、pH值，降低鹽分可提高AAP活力，增加火雞肉中蛋白質(zhì)的水解程度，提高產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)。

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