朱龍寶，葛 飛，李婉珍，陶玉貴*

(安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

L-乳酸及其衍生物廣泛應(yīng)用于食品、日用化工、制藥、紡織、環(huán)保和農(nóng)業(yè)等諸多領(lǐng)域。目前工業(yè)生產(chǎn)乳酸方法主要有化學(xué)合成法、微生物發(fā)酵法和酶轉(zhuǎn)化法[1-2]，其中發(fā)酵生產(chǎn)乳酸菌是最具潛力的一種生產(chǎn)方式。主要的生產(chǎn)菌種是乳酸桿菌，體內(nèi)的乳酸脫氫酶是糖酵解途徑中的丙酮酸還原生成L-乳酸的關(guān)鍵酶，提高該酶的活力是乳酸工業(yè)菌種分子改造和提高乳酸產(chǎn)量的關(guān)鍵[3]。

利用重組DNA、代謝工程技術(shù)，有目的改變微生物中已有的代謝網(wǎng)絡(luò)和表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)是提高L-乳酸產(chǎn)量最有效的手段之一。通過(guò)過(guò)量表達(dá)ldh基因，在合適的宿主中高效表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)提高乳酸產(chǎn)量，楊登峰等[4]將Lactobacillus rhamnosus中的ldh基因轉(zhuǎn)入E.coli F中，成功實(shí)現(xiàn)基因的表達(dá)，并成功生產(chǎn)獲得純度為99%的L-乳酸；Ferain等[5]克隆出ldh基因，導(dǎo)入Lactobacillus plantarum DG301中過(guò)量表達(dá)LDH，酶活較初始菌株提高13倍。安徽工程大學(xué)發(fā)酵工程(安徽省)技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室分離到一株干酪乳桿菌，以該菌株為出發(fā)菌，克隆出ldh基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMG-ldh，將其轉(zhuǎn)入出發(fā)菌株中，篩選出陽(yáng)性重組菌，過(guò)量表達(dá)乳酸脫氫酶，提高乳酸產(chǎn)量，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種及試劑

干酪乳酸菌(L.casei) 安徽工程大學(xué)發(fā)酵工程(安徽省)技術(shù)中心實(shí)驗(yàn)室分離；E.coli JM109、E.coli BL21(DE3) 生工生物工程(上海)股份有限公司；pMG36e 長(zhǎng)沙贏潤(rùn)生物技術(shù)有限公司。

pfu DNA聚合酶、連接酶、Marker、DNA回收試劑盒、基因組和質(zhì)粒提取試劑盒等 生工生物工程(上海)股份有限公司；各種限制性內(nèi)切酶 日本TaRaKa公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、果糖-1,6-二磷酸(FBP) 美國(guó)Sigma公司；其他試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

凝膠成像系統(tǒng)、蛋白電泳儀、電轉(zhuǎn)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；PCR擴(kuò)增儀 德國(guó)Eppendorf公司；高速臺(tái)式離心機(jī) 日本日立公司；液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；SBA40-E生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖25、玉米漿40、(NH4)2SO45、KH2PO41、MgSO4·7H2O 0.5、CaCO310，用于干酪乳桿菌培養(yǎng)；LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10、酵母提取物5、NaCl 10，用于大腸桿菌培養(yǎng)，固體培養(yǎng)基加2%的瓊脂；MRS培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖40、酵母提取物5、蛋白胨10、牛肉膏10、CH3COONa·3H2O 5、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.05、KH2PO41、C6H17N3O72、吐溫-80 1，用于干酪乳桿菌培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基加2g/100mL的瓊脂。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖120、酵母提取物7.5、蛋白胨15、牛肉膏10、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.05、吐溫-80 1、CaCO3100，調(diào)pH值為7.0。

1.4 方法

1.4.1 基因克隆

基因組DNA、質(zhì)粒DNA的提取、酶切、連接、轉(zhuǎn)化和感受態(tài)細(xì)胞制備均參照文獻(xiàn)[6]，根據(jù)GenBank(M76708.1)中公布的干酪乳桿菌LDH基因序列，設(shè)計(jì)ldh基因的特異性引物P1(5’- GCTCTAGAGTGGCAAGTATTAC-3’)和P2(5’- AACTGCAGTTACTGACGGGTTT-3’)。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性1min，52℃退火30s，72℃延伸1min，25個(gè)循環(huán)。

1.4.2 干酪乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化

將斜面菌種接種于5mL的MRS培養(yǎng)基中，40℃、150r/min培養(yǎng)12h，按1%的接種量接入新鮮的50mL MRS培養(yǎng)基中，40℃振蕩培養(yǎng)至OD600nm為0.4，無(wú)菌操作將50mL菌液冰上冰浴15min后，4℃、3000r/min離心5min，棄上清，用預(yù)冷的10%甘油充分懸浮菌體，4℃、3000r/min離心5min，棄上清，重復(fù)兩次；用400μL預(yù)冷的10%甘油重懸菌體，以每離心管100μL分裝，置于冰上備用。干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化法，參照文獻(xiàn)[7]方法。

1.4.3 重組質(zhì)粒pMG-ldh的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物和載體pMG36e分別用XbaⅠ和PstⅠ雙酶切，用T4 DNA連接酶16℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化到E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，涂布LB平板培養(yǎng)12h后挑單菌落至液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)10h，收集菌體，抽提質(zhì)粒并雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆重組質(zhì)粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.4.4 目的基因在干酪乳桿菌中表達(dá)

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pMG-ldh電轉(zhuǎn)干酪乳桿菌感受態(tài)，以空質(zhì)粒pMG36e做對(duì)照，均勻涂布含5μg/mL紅霉素的MRS平板上，40℃培養(yǎng)36～48h。挑取平板上的單菌落，接種于含5μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中，抽提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，確定重組菌L.casei pMG-ldh。

將含重組pMG-ldh的干酪乳桿菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃、100r/min過(guò)夜培養(yǎng)，按1%的接種量接種新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后期，收集菌體進(jìn)行全細(xì)胞SDS-PAGE。

1.4.5 乳酸、丙酮酸的測(cè)定

樣品預(yù)處理方法：取適量發(fā)酵液8000r/min離心15min，取上清液，加入適量1mol/L硫酸溶液酸解12h后8000r/min離心15min，取上清液，過(guò)0.22μm混合纖維素酯微孔濾膜后備用，標(biāo)準(zhǔn)品都為現(xiàn)配現(xiàn)用。

采用高效液相色譜法測(cè)定，檢測(cè)條件為：色譜柱為COSMOSIL5C18-PAQ(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相為0.2mol/L KH2PO4溶液加1%的乙腈；調(diào)pH值至2.6～2.8；真空抽濾，流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm；柱溫25℃；進(jìn)樣量為10μL。

1.4.6 NADH的測(cè)定

樣品預(yù)處理方法：取10mL發(fā)酵液，8000r/min離心10min，棄上清液，收集菌體，迅速移入液氮中以阻斷微生物細(xì)胞代謝，解凍后再以預(yù)冷的緩沖液洗滌2～3次，超聲波破碎10min后8000r/min離心10min，上清液用0.22μm混合纖維素酯微孔濾膜。

按Koning[8]和陳定強(qiáng)[9]等的方法測(cè)定，色譜分析條件為：色譜柱為COSMOSIL5C18-PAQ(4.6mm×250mm)；流動(dòng)相為0.2mol/L磷酸鈉緩沖液(含10%的乙腈和10mmol/L四丁基溴化銨)，調(diào)節(jié)pH 6.5，真空抽濾；流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；柱溫40℃；進(jìn)樣10μL。

1.4.7 殘?zhí)菧y(cè)定

采用李憲民等[10]的測(cè)定方法，利用生物傳感器分析儀測(cè)定，取20μL發(fā)酵液上清液稀釋100倍，取20μL進(jìn)樣測(cè)定。

1.4.8 細(xì)胞干質(zhì)量測(cè)定

取適量發(fā)酵液，8000r/min離心5min，棄上清液，收集菌體，用1mol/L的HCl溶液洗滌除去CaCO3固體，重復(fù)2次，再用蒸餾水懸浮菌體放置烘箱中烘干，稱得菌體干質(zhì)量(DCW)，確定DCW與菌體OD600nm值的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

1.4.9 乳酸脫氫酶活性測(cè)定

L-LDH酶活性分析參見(jiàn)文獻(xiàn)[11]，丙酮酸鈉和NADH分別用0.05mol/L乙酸緩沖液溶解，取2支比色皿，一支加入3mL丙酮酸鈉溶液作為空白對(duì)照，另一支3mL反應(yīng)體系中依次加入2.9mL丙酮酸鈉溶液和0.1mL NADH溶液并混勻，檢測(cè)初始NADH吸光度，待穩(wěn)定后，迅速加入2μL酶液，開(kāi)始光度計(jì)讀數(shù)，每15s測(cè)定一次吸光值，反應(yīng)結(jié)束后得到ΔA340nm/min值，根據(jù)下述公式計(jì)算酶活力。酶活的定義為：在40℃、pH6.7時(shí)，每分鐘氧化1μmol的NADH所用的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。

式中：VT為反應(yīng)總體積/mL；VS為樣品體積/mL；ΔA為每分鐘吸光度的降低值；b為比色皿光程/cm；ε為NADH消光系數(shù)(6.22×103L/(mol·cm))。

2 結(jié)果與分析

2.1 ldh基因克隆

以干酪乳桿菌基因組為模板，利用引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得ldh基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，泳道中1kb位置出現(xiàn)目的條帶，克隆的基因和目的基因大小一致。

圖 1 ldh基因的PCR電泳圖Fig.1 PCR amplification of ldh genes from L. casei

2.2 重組質(zhì)粒pMG-ldhL的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pMG36e經(jīng)XbaⅠ和PstⅠ雙酶切后，16℃過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109，涂布LB平板培養(yǎng)12h，挑選單菌落液體培養(yǎng)，提質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆質(zhì)粒pMG-ldh，結(jié)果見(jiàn)圖2，泳道1中出現(xiàn)1000bp目的條帶，將pMG-ldh送上海生工測(cè)序，確定正確的閱讀框。

圖 2 重組質(zhì)粒pMG-ldh的酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pMG-ldh by double enzyme digestion

2.3 ldh在干酪乳桿菌中的表達(dá)

空質(zhì)粒pMG和重組質(zhì)粒pMG-ldh分別電轉(zhuǎn)化至干酪乳桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，分別將其接種于含紅霉素的MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后期收集菌體，進(jìn)行全細(xì)胞SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖3，重組菌株經(jīng)培養(yǎng)后，與對(duì)照菌株相比，約在37kD處出現(xiàn)明顯蛋白條帶，說(shuō)明基因在干酪乳桿菌中高效表達(dá)。

圖 3 L.casei pMG-ldh在干酪乳桿菌中的表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE analysis of PMG-ldh expression in L. casei

2.4 L.casei pMG-ldh搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

2.4.1 L.casei pMG-ldh與原始菌發(fā)酵過(guò)程中乳酸脫氫酶的變化

為了比較重組菌L.casei pMG-ldh和原始菌表達(dá)乳酸脫氫酶，進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，分別將重組菌和原始菌接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶，40℃、100r/min搖瓶培養(yǎng)48h，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中LDH活性，結(jié)果如圖4所示，在發(fā)酵24h左右原始菌中LDH達(dá)到最大23U/mL，而重組菌L.casei pMG-ldh中酶活力達(dá)95U/mL，是原始菌的4.1倍。

圖 4 出發(fā)菌株和L.casei pMG-ldh發(fā)酵過(guò)程中酶活力的變化Fig.4 LDH activity of wild type and the recombinant L.casei strains

2.4.2 重組菌與原始菌的生產(chǎn)性能比較

從上述結(jié)果可知，重組菌過(guò)量表達(dá)了乳酸脫氫酶，為了進(jìn)一步研究其產(chǎn)乳酸性能，進(jìn)行了搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，分別將重組菌和原始菌接入裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶，40℃、100r/min搖瓶培養(yǎng)48h，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵參數(shù)，結(jié)果如表1所示，雖然重組菌的LDH活性大幅度提高，但乳酸的產(chǎn)率并沒(méi)比原始菌有大幅度的提高，分別為1.98g/(L·h)和2.1g/(L·h)。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，雖然重組菌的LDH活性高于原始菌，重組菌細(xì)胞內(nèi)NADH和丙酮酸與原始菌相差不大，丙酮酸和NADH水平直接影響了其發(fā)酵性能。為了進(jìn)一步提高其生產(chǎn)產(chǎn)量，分別添加4mmol/L激活劑果糖-1,6-二磷酸(FBP)和8mg/L NADH的前體物煙酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)往原始菌中添加激活劑和前體物煙酸，乳酸產(chǎn)量為105.6g/L，而L.casei pMG-ldh積累L-乳酸達(dá)128.2g/L，比原始菌提高了21.4%，原始菌在未添加激活劑和煙酸的條件下提高35%。重組菌在添加激活劑和煙酸的條件下生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到3.04g/(L·h)，相比原始菌株L.casei提高53%。添加激活劑和煙酸后，葡萄糖消耗速度明顯加快，發(fā)酵到42h葡萄糖基本耗盡，發(fā)酵提前結(jié)束，發(fā)酵周期縮短了6h。

表 1 原始菌株和重組菌發(fā)酵過(guò)程參數(shù)比較Table 1 Fermentation parameters of wild type L.casei and the recombinant L.casei pMG-ldh strains

3 討 論

為了加強(qiáng)糖酵解速率以提高葡萄糖代謝速度，提高最終產(chǎn)物乳酸濃度，一種方法是通過(guò)過(guò)量表達(dá)關(guān)鍵酶或者改變營(yíng)養(yǎng)環(huán)境條件提高EMP途徑磷酸果糖激酶等關(guān)鍵酶的酶活力[12-14]；另外可通過(guò)添加合成NAD+前體物、改變?nèi)苎?、溫度、過(guò)量表達(dá)NADH代謝相關(guān)酶等手段調(diào)節(jié)胞內(nèi)能量水平、還原力水平來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)NADH代謝的調(diào)控[15]，來(lái)實(shí)現(xiàn)乳酸產(chǎn)量的提高。

Porro等[16]將乳酸乳酸脫氫酶基因轉(zhuǎn)入野生型K.lactis酵母中過(guò)量表達(dá)乳酸脫氫酶，乳酸產(chǎn)量達(dá)109g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)0.91g/(L·h)，成功實(shí)現(xiàn)在外源宿主中實(shí)現(xiàn)乳酸脫氫酶的過(guò)量表達(dá)，并獲得較高的乳酸生產(chǎn)率。Saitoh等[17]將L-乳酸脫氫酶基因整合在釀酒酵母的染色體上，成功構(gòu)建6個(gè)拷貝的重組酵母生產(chǎn)L-乳酸，產(chǎn)量達(dá)122g/L，且光學(xué)純度達(dá)到99.9%。這些現(xiàn)象說(shuō)明增加乳酸脫氫酶基因拷貝數(shù)能夠提高乳酸的產(chǎn)量。本實(shí)驗(yàn)室篩選到一株高產(chǎn)的乳酸菌，為進(jìn)一步提高其生產(chǎn)應(yīng)能，增加乳酸脫氫酶的基因拷貝數(shù)，將乳酸脫氫酶導(dǎo)入生產(chǎn)菌中實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)。但是Ferain[5]、Davidson[18]等將乳酸脫氫酶導(dǎo)入到宿主Lactobacillus plantarum TF101中增加其拷貝數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳酸產(chǎn)量沒(méi)有大幅度的提高。這可能是由于糖代謝速率并沒(méi)有提高，增加基因的拷貝數(shù)的同時(shí)應(yīng)該提高乳酸合成途徑的代謝通量。

本實(shí)驗(yàn)以L.casei基因組為模板，PCR擴(kuò)增得到ldhL基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMG-ldhL，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入L.casei，獲得重組菌L.casei pMG-ldh，培養(yǎng)重組菌表達(dá)目的蛋白，與對(duì)照初始菌株相比，約在37kD處出現(xiàn)明顯蛋白條帶，酶活力有較大幅度的提高。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察激活劑和前體物煙酸對(duì)產(chǎn)酸的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)具有高LDH活性的重組均產(chǎn)酸速率快，生產(chǎn)強(qiáng)度提高了53%，發(fā)酵周期縮短6h，乳酸積累達(dá)128.2g/L。通過(guò)表達(dá)乳酸脫氫酶以及改變?nèi)樗崦摎涿傅幕蚩截悢?shù)，過(guò)調(diào)節(jié)乳酸脫氫酶的表達(dá)量和異源表達(dá)乳酸脫氫酶等手段可有效地改善了菌株合成乳酸的效率和所產(chǎn)乳酸的光學(xué)純度。胞內(nèi)能量和還原力水平對(duì)微生物代謝的調(diào)控是相輔相成的，可通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)NADH的形式及濃度以及所產(chǎn)生的ATP 直接或間接調(diào)節(jié)代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性，從而影響微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)及代謝功能，實(shí)現(xiàn)對(duì)碳代謝流及通量的調(diào)控，后續(xù)實(shí)驗(yàn)還需要進(jìn)一步深入研究細(xì)胞內(nèi)LDH、ATP和還原力NADH對(duì)糖降解速率的影響，優(yōu)化最佳的代謝流控制途徑，進(jìn)一步提高產(chǎn)量。

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