張 充，陸兆新*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

我國小麥品種眾多，但面粉品質(zhì)不高，在面粉后處理階段，往往應(yīng)用面粉改良劑提升面粉品質(zhì)。過去面粉改良劑多以化學(xué)合成品為主，如溴酸鉀等強筋劑和過氧化苯甲酰等增白劑。由于溴酸鉀可能導(dǎo)致動物的腎臟、甲狀腺及其他組織發(fā)生癌變，1992年WHO禁止使用溴酸鉀這種面粉強筋劑。我國也從2005年7月1日起全面禁止溴酸鉀用于面粉改良。為了避免化學(xué)改良劑所產(chǎn)生的食品安全問題，而開發(fā)以酶制劑為主體的新型、安全、高效的生物面粉改良劑，已成為國內(nèi)外面粉加工業(yè)發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。酶作為一種純天然生物制品其本身就是蛋白質(zhì)，經(jīng)食品加工后不會對人體帶來潛在的危害，因此酶制品應(yīng)用于面粉后期改良具有潛在的應(yīng)用前景，也可彌補我國國產(chǎn)小麥品質(zhì)上的不足。面粉中蛋白含量一般在8%～14%，主要由清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白構(gòu)成，其中后兩者是主要的面筋蛋白；游離糖(包括戊聚糖、阿拉伯木聚糖)占1%～2%，脂肪占1%～1.5%、灰分與0.4%，此外還有維生素、礦物質(zhì)等其他物質(zhì)。酶可以催化面粉中這些成份的聚合，而起到強筋的效果。目前研究的在面粉中直接起到強筋作用的酶有以下2類：轉(zhuǎn)移酶類，以谷胺酰胺轉(zhuǎn)氨酶為代表；氧化酶類，這類酶中包括葡萄糖氧化酶、漆酶、過氧化物酶以及脂肪氧合酶。本文綜述了這幾種酶在面粉強筋方面的研究進(jìn)展。

1 谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶在面粉改性中的應(yīng)用研究

谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transglutaminase，TGase，EC 2.3.2.13)是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，廣泛存在于動、植物和微生物體內(nèi)[1]。TGase催化機制如下：l)它可催化在蛋白質(zhì)以及肽鍵中谷氨酰胺殘基的γ-羧酰胺基和伯胺之間的酞胺基轉(zhuǎn)移反應(yīng)(圖1a)，利用該反應(yīng)可以將賴氨酸引人蛋白質(zhì)來改善面粉的營養(yǎng)特性；2)當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)中的賴氨酸殘基的γ-氨基作為?；荏w時，蛋白質(zhì)在分子內(nèi)或分子間形成ε-(γ-glutamyl) lys共價鍵(圖1b)，通過該反應(yīng)蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)，使得食品以及其他制品產(chǎn)生質(zhì)構(gòu)變化，從而賦予產(chǎn)品特有的質(zhì)構(gòu)特性和黏合性能；3)當(dāng)不存在伯胺時，水會成為酞基的受體，谷氨酞胺殘基脫去氨基，該反應(yīng)可以用于改變蛋白質(zhì)的等電點及溶解度[2-3](圖1c)。

圖 1 TGase催化反應(yīng)機制Fig.1 Catalysis mechanism of TGase

TGase促使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)的條件是底物蛋白質(zhì)需要含有一定量的賴氨酸和谷氨酰胺，同時底物蛋白的結(jié)構(gòu)也對會其催化效果產(chǎn)生影響[4-5]。一些蛋白質(zhì)，如酪蛋白等較易在其催化下發(fā)生交聯(lián)，因其含有較多的賴氨酸和谷氨酰胺組分。肉制品、奶制品是TGase商業(yè)應(yīng)用非常典型的成功例子，主要原因還是由于這2種食物蛋白中存在的氨基酸種類，能夠很好的作為TGase的催化底物。

TGase應(yīng)用于小麥面粉中，促使面筋中ε-Lys與γ-谷?；g的交聯(lián)，從而加強面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，起到氧化劑的作用，改善面團(tuán)的流變學(xué)性質(zhì)，延長粉質(zhì)穩(wěn)定時間，改善面團(tuán)的延伸性及持水率，增大面筋網(wǎng)絡(luò)的持氣性[6]。但是，由于面粉品質(zhì)的差異，面粉中氨基酸種類和含量的差異，對TGase的催化作用產(chǎn)生很大的影響。因此，TGase再面粉的實際生產(chǎn)加工與應(yīng)用方面還有一定的距離，但TGase的復(fù)配研究有可能解決底物不足的問題，如復(fù)配中加二硫蘇糖醇，打斷蛋白質(zhì)二硫鍵，暴露出更多的可供TGase催化的位點[7]。

2 葡萄糖氧化酶在面粉改性中的應(yīng)用研究

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，GOD)被認(rèn)為是“最有前途的綠色小麥粉強筋劑”，其改良效果已得到廣泛認(rèn)同。葡萄糖氧化酶在1982年首次發(fā)現(xiàn)于黑曲霉和灰綠青霉，在有氧條件下氧化葡萄糖生成δ-D-葡萄糖酸內(nèi)酯，同時生成過氧化氫(H2O2)[8]。GOD對面團(tuán)的氧化原理尚未達(dá)成共識，但大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為GOD是通過氧化－SH生成二硫鍵起作用的。由圖2可知，GOD在有氧條件下氧化D-葡萄糖產(chǎn)生H2O2，后者在過氧化氫酶催化下氧化面團(tuán)中蛋白質(zhì)的－SH生成二硫鍵－S－S－，從而增強面筋的強度[9]。Wong[10]、Hanft[11]等發(fā)現(xiàn)，添加GOD可使面團(tuán)內(nèi)W－SH及SDS－SH含量降低。Wikstrom等[12]研究了GOD與蛋白酶、VC及溴酸鉀對面團(tuán)剪切阻力的影響，發(fā)現(xiàn)GOD的作用方式與溴酸鉀接近。另外，大量流變學(xué)研究[13]表明GOD可改善面團(tuán)的粉質(zhì)拉伸及動態(tài)流變學(xué)特性，均為該理論提供了佐證。

圖 2 GOD對面粉強筋機制Fig.2 Flour gluten improvement of GOD

此外，也有學(xué)者[14]認(rèn)為 GOD 還可以促進(jìn)小麥粉中水溶性戊聚糖的氧化凝膠化，進(jìn)而增強面團(tuán)的網(wǎng)絡(luò)骨架。Wang Mingwei等[15]的研究表明，戊聚糖酶(PE)與 GOD具有協(xié)同效應(yīng)，前者水解面團(tuán)內(nèi)的大分子不溶性戊聚糖(UEAX)，生成鏈較短的可溶性戊聚糖(WEAX)，WEAX在GOD的作用下發(fā)生鏈間交聯(lián)形成凝膠，改善了面團(tuán)延展性及面包芯的品質(zhì)。

國內(nèi)外有關(guān)葡萄糖氧化酶的專利不是很多，國外關(guān)于葡萄糖氧化酶的專利多集中在面粉強筋及面包焙烤中的應(yīng)用。國內(nèi)黃衛(wèi)寧等[16]用葡萄糖氧化酶替代溴酸鉀作為生物氧化劑添加到小麥粉中，增強了小麥粉制品中面筋的筋力。黃衛(wèi)寧等[17]將葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶用于抗凍發(fā)酵冷凍面團(tuán)，利用葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶催化蛋白質(zhì)之間交聯(lián)，形成更加穩(wěn)定的面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

目前，GOD氧化形成二硫鍵的強筋機制是普遍接受的觀點，但是，仍有學(xué)者提出質(zhì)疑。1998年，Vemulapalli等[18]最先發(fā)現(xiàn)了GOD對面筋蛋白并不起作用。國際谷物化學(xué)界的權(quán)威Miller等[19]及其研究小組最初也認(rèn)為GOD的作用在于對面筋蛋白質(zhì)的氧化，但隨后的研究發(fā)現(xiàn)GOD可能導(dǎo)致了多糖結(jié)構(gòu)中阿魏酸與蛋白質(zhì)中酪氨酸的交聯(lián)。因此，隨著研究的深入，有學(xué)者認(rèn)為上述氧化蛋白質(zhì)的機理不能完全揭示GOD對面粉的強筋機制。另外GOD在實際的生產(chǎn)應(yīng)用方面也存在著缺陷。首先，缺乏優(yōu)良的GOD基因，在體系中穩(wěn)定性較差，容易發(fā)生物理化學(xué)變性。另一個原因是缺乏高產(chǎn)GOD的菌種及酶的大規(guī)模生產(chǎn)制備技術(shù)。因此，關(guān)于 GOD今后的研究應(yīng)集中在：1)徹底闡明強筋機理：GOD在面粉強筋過程中除了催化二硫鍵的形成外，是否對面粉蛋白的其他氨基酸，以及面粉中的多糖產(chǎn)生作用；2)篩選或突變獲得優(yōu)良菌株：從多種環(huán)境中篩選產(chǎn)酶高、催化反應(yīng)優(yōu)良的菌種，或者利用物理、化學(xué)、分子生物學(xué)手段對已有的產(chǎn)GOD的菌株進(jìn)行誘變處理。3)優(yōu)良菌種的發(fā)酵條件的探討構(gòu)建；4)建立大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)。

3 漆酶在面粉改性中的應(yīng)用研究

漆酶(laccase，Lac，EC1.10.3.2)是自然界普遍存在的一種含銅金屬酶類，可催化各種酚類物質(zhì)如兒茶酸、單寧、黃酮等氧化為醌，是兒茶酚氧化酶和漆酶的統(tǒng)稱[20]。Lac可以催化蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)聚合，可能是由于Lac能催化蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基以及與蛋白質(zhì)通過非肽鍵相連的酚類化合物的氧化來實現(xiàn)[21](圖3)。另外，多酚氧化酶可使酚類化合物氧化成醌，而醌類化合物也可與蛋白質(zhì)的氨基、巰基、吲哚基等基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)從而導(dǎo)致蛋白聚合。

圖 3 Lac催化酪氨酸殘基氧化Fig.3 Tyrosine oxidation catalysis by Lac

在面團(tuán)形成和烘焙過程中，Lac所參與的催化強筋作用與阿魏酸和阿拉伯木聚糖有著密不可分的關(guān)系。Labat等[22]報道了漆酶和阿魏酸在面團(tuán)上應(yīng)用的效果，當(dāng)漆酶與阿魏酸同時添加到生面團(tuán)中，通過漆酶對阿拉伯木聚糖中的阿魏酸酯的二聚作用來催化凝膠化；同時增加了混合期間巰基的氧化作用以及蛋白質(zhì)的解聚作用，在氧化的面筋/水溶性戊聚糖混合物中發(fā)現(xiàn)阿拉伯木聚糖和蛋白質(zhì)之間的共價配合物。氧化酶增加了面團(tuán)的連接性，降低了阿拉伯木聚糖的水溶性，從而來提高面筋強度。在面包加工方面，漆酶的使用可以增加面包體積，改善面包結(jié)構(gòu)和柔軟性。Carunchio等[23]以真菌漆酶純酶為研究材料，發(fā)現(xiàn)漆酶具有使面粉多糖中的阿魏酸發(fā)生相互交聯(lián)的作用；Mattinen等[21]發(fā)現(xiàn)真菌來源的純化的漆酶對面筋蛋白中的酪氨酸有催化聚合作用。

目前，國內(nèi)外研究主要集中于真菌漆酶，在菌種選育、發(fā)酵條件以及在環(huán)境治理方面有大量的報道[24-26]。有關(guān)漆酶在食品加工，尤其是面粉改良方面的研究報道還不多。在食品加工中，可能受到制約的一個主要因素是酶的熱穩(wěn)定性問題，因為絕大多數(shù)的真菌漆酶的熱穩(wěn)定性不高。但有最新報道表明[27-28]，細(xì)菌漆酶，如芽孢桿菌類的一些菌株，能產(chǎn)生耐熱性良好的漆酶。今后在產(chǎn)酶菌株方面的研究應(yīng)關(guān)注于細(xì)菌來源的漆酶。

4 過氧化物酶在面粉改性中的應(yīng)用研究

過氧化物酶(peroxidase，POD，EC1.11.1.7)是一類以血紅素為輔基的酶，廣泛存在于各種動物、植物和微生物體內(nèi)，可催化過氧化氫對多種有機物和無機物的氧化作用，當(dāng)無過氧化氫存在時，氧分子可作為氫受體發(fā)生氧化反應(yīng)[29]。

國內(nèi)外有關(guān)POD對面粉具有強筋作用的研究，主要集中在對面粉中多糖、蛋白質(zhì)的交聯(lián)作用上。有學(xué)者[30]從小麥面粉和小麥麩中分離了阿魏酰阿拉伯木聚糖，對POD作用的氧化交聯(lián)進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在POD/H2O2反應(yīng)體系下，可催化阿魏酰阿拉伯木聚糖二聚體的形成。

Figueroa-Espinoza等[31]研究了錳過氧化物酶(MnP)對阿拉伯木聚糖的交聯(lián)作用，結(jié)果表明MnP通過兩條途徑催化面粉中相關(guān)物質(zhì)的交聯(lián)：1) MnP催化阿魏酰阿拉伯木聚糖，產(chǎn)物半醌類阿魏酰阿拉伯木聚糖自由基，后者催化面粉中自由巰基生成二硫鍵，從而發(fā)揮強筋作用；2) MnP催化阿魏酰阿拉伯木聚糖脫甲基，生成咖啡酰阿拉伯木聚糖，在Mn3+作用下生成半醌類咖啡酰阿拉伯木聚糖，進(jìn)而催化與含巰基氨基酸的聚合，形成糖類-蛋白的復(fù)合體(圖4)。

圖 4 POD催化含巰基氨基酸的聚合(a)和 POD催化阿魏酰阿拉伯木聚糖與巰基氨基酸二聚體形成(b)Fig.4 Polymerization of mercaptoamino-acid catalysis by POD (a) and dimerization of feruloylated arabinoxylans and mercaptoamino-acid catalysis by POD (b)

Oudgenoeg等[32]研究發(fā)現(xiàn)辣根過氧化物純酶能夠催化阿魏酸與酪氨酸的聚合作用。Boeriu等[33]也發(fā)現(xiàn)在POD/H2O2的作用下可使酪氨酸與阿魏酰阿拉伯木聚糖發(fā)生交聯(lián)聚合，首先是酪氨酸殘基與阿魏酰阿拉伯木聚糖中的酚基作為供氫體在POD/H2O2的催化下氧化而分別形成酪蛋白的聚合體與阿魏酰阿拉伯木聚糖的聚合體(圖5)。

圖 5 POD催化酪氨酸與阿魏酸聚合Fig.5 Polymerization of tyrosine and ferulaic acid catalysis by POD

根據(jù)目前研究報道，對POD增強面筋交聯(lián)作用的可能機制歸納如下：1)面粉中多糖物質(zhì)的交聯(lián)作用：POD催化水溶性阿魏酰阿拉伯木聚糖二聚體的形成；2)面粉中蛋白質(zhì)間的交聯(lián)：POD催化含巰基的氨基酸之間的二硫鍵的形成；3)面粉多糖與蛋白質(zhì)間的交聯(lián)作用：POD催化酪氨酸與阿魏酸間醚鍵的形成；POD催化阿魏酰阿拉伯木聚糖與巰基氨基酸聚合體的形成。

5 脂肪氧合酶在面粉改性中的應(yīng)用研究

脂肪氧合酶(lipoxygenase，LOX，EC1.13.11.12)，是一種含非血紅素鐵的蛋白，酶蛋白由單肽鏈組成，分子質(zhì)量范圍一般在90000～100000D之間，專門催化具有順,順-1,4戊二烯結(jié)構(gòu)的不飽和脂肪酸的加氧反應(yīng)，形成具有共軛雙鍵的氫過氧化物，這些氫過氧化物性質(zhì)活潑，是重要的化學(xué)反應(yīng)中間體[34]。研究表明，面粉中添加大豆粉而產(chǎn)生的強筋和漂白作用是由大豆粉中的脂肪氧合酶引起的[35-36]。Dunnewind等[37]以純化的大豆LOX為材料，研究發(fā)現(xiàn)LOX純酶能夠提高面團(tuán)的拉伸性能和持水性。Toyosaki等[38]通過SDS-PAGE的方法研究了LOX對面筋蛋白的聚合作用，結(jié)果表明經(jīng)LOX處理的樣品，經(jīng)SDS-PAGE檢測出的分子質(zhì)量明顯高于對照組。

早期研究認(rèn)為[39]，由大豆粉中LOX催化不飽和脂肪酸形成的氫過氧化物能氧化蛋白質(zhì)分子中的－SH形成－S－S－并能誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子聚合，使蛋白質(zhì)分子變得更大，從而起到強化面筋的作用(圖6)。

隨著研究的深入，學(xué)者們也都推測LOX與面筋筋力相關(guān)因素——面粉中淀粉多糖以及面筋蛋白中的氨基酸有著密不可分的關(guān)系，但是缺乏有力的實驗證據(jù)。然而在用商品化的LOX純酶為材料進(jìn)行的研究中，只是研究了面團(tuán)流變學(xué)和拉伸性能等宏觀變化等[37]，但是沒有對強筋機制進(jìn)行深入研究。因此，嚴(yán)格地說到目前為止，LOX在面粉強筋機理還沒有清楚地被闡明。需要針對LOX的單一組分與面筋蛋白、面粉中多糖之間的酶促機制進(jìn)行全面、深入的研究。而目前商品化的LOX純酶提取工藝復(fù)雜，價格昂貴，即使明確了其機理，高成本也會制約LOX應(yīng)用前景。因此，探尋能獲得低成本、高純度的酶的研究材料，是解決LOX在面粉強筋應(yīng)用的關(guān)鍵因素。

圖 6 LOX催化面粉中二硫鍵的形成Fig.6 Formation of disulfide bond catalysis by LOX in flour

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，就有關(guān)LOX的基因的挖掘、應(yīng)用展開了大量研究。從魚腥藻PCC7120(Anabaena sp. PCC 7120)的基因組中克隆獲得脂肪氧合酶基因。在E.coli中獲得了高效活性表達(dá)，表達(dá)量比已報道的最高的重組LOX酶活提高了50倍以上，通過簡單純化過程獲得了純酶[40]，并對其在面粉中的應(yīng)用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)重組Ana-LOX對面筋蛋白具有很好的交聯(lián)效果(圖7)。經(jīng)過重組Ana-LOX改良的面團(tuán)制作出的面包體積，明顯優(yōu)于未處理的對照組。

圖 7 面團(tuán)的SEM顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.7 SEM of dough

同時，為了實現(xiàn)重組Ana-LOX的低成本純化目的，進(jìn)行了Ana-LOX的食品級枯草桿菌表達(dá)系統(tǒng)研究。構(gòu)建了一個Ana-LOX的高效分泌表達(dá)載體，建立了一套枯草桿菌無抗生素篩選的方法，構(gòu)建獲得了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的食品級工程菌宿主菌[41-42]。

而在應(yīng)用過程中，目前已被發(fā)現(xiàn)的脂肪氧合酶，包括Ana-LOX的熱穩(wěn)定性并不理想。針對該問題，本實驗室也在嘗試通過非理性設(shè)計和理性設(shè)計的方法提高Ana-LOX的熱穩(wěn)定性。非理性策略中，對于突變基因的高通量篩選方法的建立是至關(guān)重要的。例如郭芳芳等[43]建立了碘化鉀-淀粉法快速測定脂肪氧合酶的方法，獲得的突變體LOX-120、LOX-422在50℃條件下的半衰期t1/2比野生酶分別提高到1.9倍和1.8倍。

理性設(shè)計是建立在對目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)了解較為深入的基礎(chǔ)上。大豆脂肪氧合酶的晶體結(jié)構(gòu)已被解析，通過同源建?？梢灶A(yù)測不同來源的脂肪氧合酶的空間結(jié)構(gòu)。Cristea等[44]在研究Mn脂肪氧合酶過程中，在模擬Mn脂肪氧合酶空間結(jié)構(gòu)和活性中心的基礎(chǔ)上，對其進(jìn)行了定點突變研究，發(fā)現(xiàn)突變基因表達(dá)出的重組酶喪失了活性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)突變重組酶檢測不到Mn離子，該結(jié)果提示活性中心的氨基酸殘基的改變對酶的性質(zhì)具有重要影響。課題組運用生物信息學(xué)相關(guān)軟件，預(yù)測了Ana-LOX的三維空間結(jié)構(gòu)(圖8a)及Ana-LOX活性中心位點(圖8b)，定位鐵離子的5個氨基酸殘基分別為His197、His202、His369、Asn373和Ile455。為了驗證上述預(yù)測，已對上述5個位點進(jìn)行了大量定點突變研究。雖然未獲得性質(zhì)改良的酶基因，但證實了上述5個位點確實為Ana-LOX的活性中心位點[40]。因此，在此基礎(chǔ)上，對活性中心周圍(空間結(jié)構(gòu))進(jìn)行定點突變，獲得熱穩(wěn)定提高的酶基因，具備一定的理論基礎(chǔ)和技術(shù)的可行性。

圖 8 Ana-LOX模擬的三維空間結(jié)構(gòu)(a)和 Fe3+在Ana-LOX活性中心定位模型(b)Fig.8 Analogous three-dimension structure of Ana-LOX (a) and analogous allocation of Fe3+ in the active center of Ana-LOX (b)

6 其他酶類在面粉改性中的應(yīng)用研究

除上述在面粉加工中可以起到直接催化交聯(lián)的酶之外，還有一些酶通過其在面粉中的催化反應(yīng)，間接的起到強筋的效果。脂肪酶可以將甘油三酯水解生成甘油二酯或甘油一酯或甘油，面粉中的脂肪經(jīng)脂肪酶分解后生成具有乳化作用的物質(zhì)，在面筋網(wǎng)絡(luò)和淀粉之間起乳化的作用，改善面團(tuán)的結(jié)構(gòu)，增大面制品的體積[45]。淀粉酶是一種在面粉改良中應(yīng)用非常普遍的酶制劑，其效果非常顯著。α-淀粉酶可以作用于面粉中的破損淀粉，生成糊精，使得面粉的結(jié)構(gòu)細(xì)密，在加工過程中會很好的增加持汽性。另外，經(jīng)淀粉酶作用后產(chǎn)生葡萄糖，增加GOD的底物，強筋效果優(yōu)于單獨添加GOD。添加淀粉酶也要適量，過度添加會使面制品的體積變小，而且容易老化[46]。戊聚糖酶可以將水不溶的戊聚糖分解為水溶性的戊聚糖，并伴隨游離阿拉伯基木聚糖和阿魏酸含量的提高，從而增強漆酶和過氧化物酶的作用效果[47]。

7 結(jié) 語

隨著人們生活水平的提高，對面制品的安全性、品質(zhì)性的要求也逐步提高。溴酸鉀作為傳統(tǒng)的面粉強筋劑已被取締，綠色天然的酶制劑是最佳的面粉強筋劑。目前，多種酶已發(fā)現(xiàn)在面粉強筋過程中起到直接的催化作用，而純酶制備成本過高是制約應(yīng)用的主要瓶頸。在闡明酶催化強筋機制的基礎(chǔ)之上，研究方向的重點趨向于如何獲得大量純化酶制劑、如何解決酶制劑的儲藏穩(wěn)定性和在面粉加工中穩(wěn)定性問題。另外，通過應(yīng)用宏基因組學(xué)、生物信息學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及分子生物學(xué)的方法和手段，探索和開發(fā)新的面粉改良酶制劑，實現(xiàn)酶制劑在面粉加工中的應(yīng)用。

[1] MOTOKI M, SEGURO K. Transglutaminase and its use for food processing[J]. Trends Food Science Technology, 1998, 9： 204-210.

[2] 常中義, 江波, 王璋. 微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2000, 21(9)： 6-8.

[3] ZHU Y. Microbial transglutaminase： a review of its production and application in food processing[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1995, 44： 277-282.

[4] FALCONE P, SERAFINI-FRACASSINI D, DEL-DUCA S. Comparative studies of transglutaminase activity and substrates in different organs of Helianthus tuberosus[J]. Journal of Plant Physiology, 1993, 142： 263-273.

[5] YASUEDA H, KUMAZAWA Y, MOTOKI M. Purification and characterization of a tissue-type transglutaminase from red sea bream (Pagrus major)[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 1994, 58： 2041-2045.

[6] 寇明鈺, 趙國華, 闞健全. 谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶及其在食品工業(yè)中的作用[J]. 中國食品添加劑, 2004(5)： 81-88.

[7] ABOUMAHMOUD R, SAVELLO P. Crosslinking of whey protein by transglutaminase[J]. Journal of Dairy Science, 1990, 73(2)： 256-263.

[8] WITT S, WOHLFAHRT G, SCHOMBURG D, et al. Conserved arginine-516 of Penicillium amagasakiense glucose oxidase is essential for the efficient binding of β-D-glucose[J]. The Biochemical Journal, 2000, 347： 553-559.

[9] STEFFOLANI M E, RIBOTTA P D, ALBERTO E L, et al. Effect of glucose oxidase, transglutaminase, and pentosanase on wheat proteins： relationship with dough properties and bread-making quality[J]. Journal of Cereal Science, 2010, 51： 366-371.

[10] WONG C M, WONG K H, CHEN X D. Glucose oxidase： natural occurrence, function, properties and industrial applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008, 78： 927-938.

[11] HANFT F, KOEHLER P. Studies on the effect of glucose oxidase in bread making[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2006, 86： 1699-1702.

[12] WIKSTROM K, ELIASSON A C. Effect of enzymes and oxidizing agents on shear stress relaxation of meat flour dough： addition of protease, glucose oaidase, ascorbic acid, and potassium bromate[J]. Cereal Chemistry, 1998, 75： 331-337.

[13] CABALLERO P A, GOMEZ M, ROSELL C M. Improvement of dough rheology, bread quality and bread shelf-life by enzymes combination [J]. Journal of Food Engineering, 2007, 81： 42-45.

[14] DECAMPS K, JOYE I J, HALTRICH D, et al. Biochemical characteristics of Trametes multicolor pyranose oxidase and Aspergillus niger glucose oxidase and implications for their functionality in wheat flour dough[J]. Food Chemistry, 2012, 131(4)： 1458-1492.

[15] WANG Mingwei, VLIET T V, HAMER R J. Evidence that pentosans and xylanase affect the re-agglomeration of the gluten network [J]. Journal of Cereal Science, 2004, 39： 341-349.

[16] 黃衛(wèi)寧, 鄒奇波. 賈春利. 一種用于面制品中可代替溴酸鉀的生物氧化劑： 中國, 200610037642[P]. 2006-10-03.

[17] 黃衛(wèi)寧, 賈春利. 一種含有葡萄糖氧化酶和過氧化物酶的抗凍發(fā)酵冷凍面團(tuán)及其生產(chǎn)方法： 中國, 2005, 200510094856[P]. 2005-10-09.

[18] VEMULAPALLI V, MILLER K A, HOENEY R C. Glucose oxidase in breadmaking system[J]. Cereal Chemistry, 1998, 75： 439-442.

[19] MILLER K A, HOSENEY R C. Effect of oxidation on the dynamic rheological properties of wheat flour-water doughs[J]. Cereal Chemistry, 1999, 76： 100-104.

[20] GIANFREDA L, XU F, BOLLAG J M. Laccase： a useful group of oxidoreductive enzymes[J]. Bioremediation Journal, 1999, 3： 1-25.

[21] MATTINEN M L, KRUUS K, BUCHERT J, et al. Laccase catalyzed polymerization of tyrosine-containing peptides[J]. FEBS, 2005, 272： 3640-3650.

[22] LABAT E, MOREL M H, ROUAU X. Effect of laccase and ferrulic acid on wheat flour doughs[J]. Cereal Chemistry, 2000, 77： 823-828.

[23] CARUNCHIO F, CRESCENZI C, GIRELLI A M, et al. Oxidation of ferulic acid by laccase： identification of the products and inhibitory effects of some dipeptides[J]. Talanta, 2001, 55： 189-200.

[24] FOROOTANFAR H, FARAMARZI M A, SHAHVERDI A R, et al. Purification and biochemical characterization of extracellular laccase from the ascomycete Paraconiothyrium variabile[J]. Bioresource Technology, 2011, 102： 1808-1804.

[25] HALABURGI V M, SHARMA S, SINBA M, et al. Purification and characterization of a thermostable laccase from the ascomycetes Cladosporium cladosporioides and its applications[J]. Process Biochemistry, 2011, 46： 1146-1152.

[26] BALDRIAN P. Fungal laccases-occurrence and properties[J]. FEMS Microbiol Review, 2006, 30： 215-242.

[27] ZHANG C, DIAO H W, LU F X, et al. Degradation of triphenylmethane dyes using using temperature and pH stable laccase from a strain of Bacillus vallismortis[J]. Bioresource Technology, 2012, 126： 80-86.

[28] LU L, ZHAO M, WANG T N, et al. Characterization and dye degradation ability of an alkaline resistant and organic solvents tolerant laccase from Bacillus licheniformis LS04[J]. Bioresource Technology, 2012, 115： 35-40.

[29] 田國忠, 李懷方, 裘維蕃. 植物過氧化物酶研究進(jìn)展[J]. 武漢植物學(xué)研究, 2001, 19(4)： 332-344.

[30] SCHOONEVELD-BERGMANS M E F, DIGNUM M J W, GRABBER J H, et al. Studies on the oxidative cross-linking of feruloylated arabinoxylans from wheat flour and wheat bran[J]. Carbohydrate Polymers, 1999, 38(4)： 309-317.

[31] FIGUEROA-ESPINOZA M C, MOREL M H, SURGET A, et al. Oxidative cross-linking of wheat arabinoxylans by manganese peroxidase. Comparison with laccase and horseradish peroxidase. Effect of cysteine and tyrosine on gelation[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 1999, 79： 460-463.

[32] OUDGENOEG G, HILHORT R, PIERSMA S R, et al. Peroxidasemediated cross-linking of a tyrosine-containing peptide with ferulic acid[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2001, 49(5)： 2503-2510.

[33] BOERIU C G. Horseradish peroxidase-catalyzed cross-linking of feruloylated arabinoxylans with beta-casein[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52(21)： 6633-6639.

[34] 李彩鳳, 趙麗影, 陳業(yè)婷, 等. 高等植物脂氧合酶研究進(jìn)展[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2010, 41(10)： 143-149.

[35] HOOVER W. Use of soy proteins in baked foods[J]. Journal of the American Oil Chemists Society, 1979, 56： 301-303.

[36] FAUBION J M, HOSENEY R C. Lipoxygenase： its biochemistry and role in breadmaking[J]. Cereal Chemistry, 1981, 58： 175-180.

[37] DUNNEWIND B, VLIE V T, ORSEL R. Effect of oxidative enzymes on bulk rheological properties of wheat flour doughs[J]. Journal of Cereal Science, 2002, 36： 357-366.

[38] TOYOSAKI T. Effects of hydroperoxide in lipid peroxidation on dough fermentation[J]. Food Chemistry, 2007, 104： 680-685.

[39] SHEWRY P R, TATHAM A S, BARRO F, et al. Biotechnology of breadmaking： unravelling and manipulating the multi-protein gluten complex[J]. Biotechnology, 1995, 13： 1185-1190.

[40] 張充, 周孝偉, 呂鳳霞, 等. 重組魚腥藻脂肪氧合酶基因克隆表達(dá), 分離純化及酶學(xué)性質(zhì)的研究[J]. 生物工程學(xué)報, 2012, 28(4)： 440-456.

[41] ZHANG C, TAO T T, YING Q, et al. Extracellular production of lipoxygenase from Anabaena sp. PCC 7120 in Bacillus subtilis and its effect on wheat protein[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 94(4)： 949-958.

[42] ZHANG C, ZHANG X H, YAO Z Y, et al. A new method for multiple gene inactivations in Bacillus subtilis 168, producing a strain free of selectable markers[J]. Canadian Journal of Microbiology, 2011, 57(5)： 427-436.

[43] 郭芳芳, 應(yīng)琦, 張充, 等. 重組脂肪氧合酶基因工程菌破碎條件優(yōu)化及其酶活力測定方法研究[J]. 食品科學(xué), 2013.1.7網(wǎng)絡(luò)出版.

[44] CRISTEA M, ENGSTR M ?, SU C, et al. Expression of manganese lipoxygenase in Pichia pastoris and site-directed mutagenesis of putative metal ligands[J]. Archives od Biochemistry and Biophysics, 2005, 434(1)： 201-210.

[45] 王學(xué)東, 李慶龍, 張聲華. 外源脂肪酶對國產(chǎn)小麥面包粉品質(zhì)的影響[J]. 食品科學(xué), 2003, 24(7)： 96-99.

[46] 劉愛國, 陳慶森, 祁兵, 等. 淀粉酶和糖化酶在冷凍食品中的應(yīng)用研究[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(4)： 115-118.

[47] 王學(xué)東, 李慶龍, 張聲華. 外源戊聚糖酶對國產(chǎn)小麥面包粉品質(zhì)的影響[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(11)： 41-44.