王韋崗

（鎮(zhèn)江市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，江蘇鎮(zhèn)江 212132）

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉的代謝產(chǎn)物，是一種常見(jiàn)的腐生真菌，多見(jiàn)于發(fā)霉的糧食、糧食制品及其它霉腐的有機(jī)物上，其主要存在形式為B1，B2，G1，G2。在天然污染的食品中以黃曲霉毒素B1最為常見(jiàn)，其毒性和致癌性最強(qiáng)。1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為一級(jí)致癌物，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)［1］。研究表明，長(zhǎng)期食用被黃曲霉毒素污染的食物將導(dǎo)致肝癌、胃癌、腸癌等疾病，為了防止黃曲霉毒素危害人類(lèi)健康，世界各國(guó)對(duì)黃曲霉毒素在食品中的殘留限量做了嚴(yán)格的規(guī)定［2］。

黃曲霉毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法和高效液相色譜法［3-5］。劉曉茂等［6］采用超高壓液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食用植物油中的黃曲霉毒素，該方法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)和定量結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但儀器較為昂貴，使用成本高，很難普及應(yīng)用，且凈化過(guò)程繁瑣，需要消耗大量有機(jī)溶劑。筆者采用Mycosep 228 Afl aPat多功能凈化柱處理樣品，應(yīng)用光化學(xué)衍生，結(jié)合高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定牛奶中的黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2。該法具有操作簡(jiǎn)單、速度快、消耗溶劑少等優(yōu)點(diǎn)，為實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展黃曲霉毒素的檢測(cè)提供參考方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters e2695型，主要包括2475熒光檢測(cè)器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、自動(dòng)脫氣四元梯度泵等，美國(guó)Waters公司；

光化學(xué)衍生器：HM11104型，北京華安麥科生物技術(shù)有限公司；

氮?dú)獯蹈蓛x：HP-5016型，上海洛成分析儀器有限公司；

漩渦混勻器：IKA MS3 basic型，德國(guó)IKA公司；

離心機(jī)：TDZ5-WS型，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；

超生波清洗機(jī)：SB-800DT型，寧波新芝生物科技有限公司；

超純水系統(tǒng)：Milli-Q型，美國(guó)Millipore公司；

多功能凈化柱（MFC）：Mycosep 228 Afl aPat，美國(guó)Romer Labs公司；

甲醇、乙腈：色譜純；

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2標(biāo)準(zhǔn)品：2.0 μg／mL，美國(guó)Sigma公司；

實(shí)驗(yàn)用水為Millpore超純水系統(tǒng)制得。

1.2 儀器分析條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流 動(dòng) 相：甲 醇-乙 腈-水（體 積 比 為25∶20∶55），流速為1.0 mL／min；進(jìn)樣體積：20 μL；柱溫：30℃；熒光檢測(cè)器：激發(fā)波長(zhǎng)355 nm，發(fā)射波長(zhǎng)430 nm。

1.3 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g（精確到0.01 g）試樣至50 mL具塞離心管中，加入25 mL乙腈-水混合溶液（體積比為80∶20），漩渦混勻后超聲提取30 min，以4 000 r／min離心10 min，吸取10 mL上清液至多功能凈化柱的玻璃試管中，將裝有填料的多功能凈化柱插入玻璃試管，并緩慢推動(dòng)多功能凈化柱至玻璃試管的底部，上清液通過(guò)多功能凈化柱中的填料并與填料充分接觸，移取1 mL通過(guò)多功能凈化柱的凈化液于另一玻璃試管中，60℃加熱,氮?dú)獯蹈?，再加? mL流動(dòng)相溶解混勻，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 凈化方法

多功能凈化柱（MFC）是一種特殊的固相萃取柱，其填料中含有親脂性（非極性）和電荷活性（極性）成分，可選擇性吸附樣品提取液中的脂類(lèi)、蛋白質(zhì)類(lèi)化合物和碳水化合物等干擾物質(zhì)，而讓待測(cè)化合物通過(guò)凈化柱，從而達(dá)到分離純化的目的［7］。多功能凈化柱操作簡(jiǎn)便，不需要進(jìn)行活化、淋洗和洗脫等操作，縮短了樣品的前處理時(shí)間。筆者選用美國(guó)Romer Labs公司的Mycosep 228 Afl aPat多功能凈化柱，對(duì)牛奶樣品中的黃曲霉毒素進(jìn)行分離純化，取得了十分理想的效果。

2.2 提取方法

樣品的提取方法主要根據(jù)其物理化學(xué)性質(zhì)來(lái)確定。黃曲霉毒素易溶于極性溶劑而不溶于非極性溶劑，且在中性溶液中較穩(wěn)定，一般使用甲醇、乙腈、丙酮、氯仿或幾種有機(jī)溶劑的混合液對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行提取。黃曲霉毒素雖然難溶于水，但是提取液中少量的水可以潤(rùn)濕基質(zhì)，增強(qiáng)有機(jī)溶劑在樣品中的滲透能力，因此采用有機(jī)溶劑與水的混合溶液作為提取劑，可以提高樣品的提取效率。分別以乙腈-水體積比為20∶80，40∶60，60∶40，80∶20和100∶0為提取劑對(duì)牛奶中黃曲霉毒素進(jìn)行提取，結(jié)果表明，以乙腈-水體積比為80∶20時(shí)的提取效率最高，回收率在85%以上。

2.3 衍生方法

高效液相色譜法已經(jīng)成為檢測(cè)黃曲霉毒素的主要測(cè)定方法，但是黃曲霉B1和G1的熒光強(qiáng)度較弱，且黃曲霉毒素B1在水溶液中會(huì)發(fā)生熒光淬滅，因此需要采用衍生的方法增強(qiáng)B1和G1的熒光強(qiáng)度。常用的衍生方法有柱前三氟乙酸衍生［8］、柱后碘衍生［9］等，但衍生過(guò)程復(fù)雜、檢測(cè)靈敏度及重現(xiàn)性受人為因素影響較大。本實(shí)驗(yàn)利用環(huán)狀化合物在紫外光照射下能產(chǎn)生熒光這一特性，采用光化學(xué)衍生技術(shù)，以流動(dòng)相中的水作為衍生劑，對(duì)黃曲霉毒素進(jìn)行衍生化處理，使流動(dòng)相中的水與黃曲霉毒素B1作用，生成熒光特性更強(qiáng)、更穩(wěn)定的化合物，從而解決了黃曲霉毒素B1在水溶液中發(fā)生熒光淬滅的問(wèn)題，而且增加了黃曲霉毒素的熒光強(qiáng)度［10］。

2.4 線(xiàn)性范圍和檢出限

分別稱(chēng)取適量黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2標(biāo)準(zhǔn)品溶于甲醇，配成質(zhì)量濃度為60 ng／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。吸取適量體積黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用流動(dòng)相稀釋配成相應(yīng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并按選定的色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的質(zhì)量濃度與其峰面積具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)在0.999 4～0.999 9之間，相應(yīng)的線(xiàn)性回歸方程見(jiàn)表1。在空白牛奶樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)品，按上述方法處理樣品，根據(jù)3倍信噪比（S／N）峰的響應(yīng)值計(jì)算，得到黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的檢出限分別為0.50，0.10，0.50，0.10 μg／kg。牛奶加標(biāo)樣品的色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 黃曲霉毒素的線(xiàn)性回歸方程和方法檢出限

圖1 牛奶加標(biāo)樣品的色譜圖

2.5 回收試驗(yàn)與精密度試驗(yàn)

在牛奶空白樣品中加入3組不同濃度水平的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品處理和測(cè)定，考察實(shí)驗(yàn)方法的回收率，并對(duì)加標(biāo)樣品重復(fù)測(cè)定6次，考察實(shí)驗(yàn)方法的精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的回收率為85.6%～92.0%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.72%～3.52%。

3 結(jié)語(yǔ)

建立了一種以高效液相色譜-熒光檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)牛奶中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2的方法。采用Mycosep 228 Afl aPat多功能凈化柱對(duì)牛奶樣品中的黃曲霉毒素進(jìn)行分離純化，并用柱后光化學(xué)衍生技術(shù)增加黃曲霉毒素的熒光強(qiáng)度。該方法具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，為牛奶中黃曲霉毒素的檢測(cè)提供了實(shí)用的技術(shù)手段。

表2 牛奶樣品中黃曲霉毒素加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果

［1］柳潔，何碧英.黃曲霉毒素高效液相色譜檢測(cè)方法研究進(jìn)展［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2005，15(7): 891-896.

［2］王新麗，張玉黔. HPLC柱后衍生同時(shí)測(cè)定黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的探討［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2012，22(2): 225-226.

［3］竇玉平.薄層層析法測(cè)定糧食中的黃曲霉毒素B1［J］.吉林農(nóng)業(yè)，2011(1): 23.

［4］廖妍儼，黃家?guī)X.酶聯(lián)免疫法檢測(cè)牛奶中黃曲霉毒素M1的應(yīng)用［J］. 貴州化工，2012，37(4): 33-39.

［5］于成廣，黃輝. UPLC-MS-MS 法快速測(cè)定玉米中的黃曲霉毒素B1［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2012，21(2): 81-83.

［6］劉曉茂，李學(xué)民，王飛，等.超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食用植物油中4種黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2［J］.食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2012，3(5): 513-518.

［7］朱孟麗.用Mycosep TM凈化柱和高效液相色譜法對(duì)谷物中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的測(cè)定［J］.飼料工業(yè)，2006，27(3): 36-38.

［8］SN0339-1995 出口茶葉中黃曲霉毒素B1的檢驗(yàn)方法［S］.

［9］GB／T 18979-2003 食品中黃曲霉毒素的測(cè)定免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法［S］.

［10］李軍，于一茫，田苗，等.免疫親和柱凈化-柱后光化學(xué)衍生-高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)糧谷中的黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素A［J］.色譜，2006，24(6): 581-584.