王仁俊，溫美玲，寇正涌，李 華，郝錫聯(lián)，趙 卓，周 革，周曉馥

多種心血管疾病（冠心病、高血壓等）的終末階段都表現(xiàn)為慢性心力衰竭，是嚴重危害人類健康的心臟疾病。雖然臨床上用β受體抑制劑、腎素-血管緊張素醛固酮系統(tǒng)阻滯劑等對此有一定的治療作用，但其確診后四年病死率仍高達50%，目前仍缺乏有效的治療手段。

研究顯示，慢性心衰的重要病理特征是交感傳出神經(jīng)興奮性增強[1]。導致心衰狀態(tài)下交感神經(jīng)興奮性增強的主要原因可能與中樞作用機制改變有關(guān)[2-5]。但是，慢性心衰情況下下丘腦室旁核（PVN）內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)參與交感神經(jīng)興奮亢進的確切機制仍不十分清楚。眾所周知，下丘腦室旁核是調(diào)節(jié)交感緊張性的重要神經(jīng)核團，許多神經(jīng)遞質(zhì)參與PVN部位的調(diào)節(jié)作用。目前認為抑制性反應主要是由γ-氨基丁酸（GABA）參與完成，而合成GABA的限速酶由分子量為67kDa的谷氨酸脫羧酶（GAD67）和分子量為65kDa的谷氨酸脫羧酶（GAD65）兩種亞型存在[6-7]，其中GAD67在GABA合成中發(fā)揮主要作用[8]。另有研究報道顯示心衰狀態(tài)下下丘腦室旁核GABA合成量明顯下降[9-10]，研究結(jié)果提示心衰狀態(tài)下下丘腦室旁核谷氨酸脫羧酶表達量發(fā)生改變。這種下丘腦室旁核合成γ-氨基丁酸限速酶表達的失衡及其功能的衰減與心衰狀態(tài)下交感神經(jīng)興奮亢進密切相關(guān)，而慢性心衰大鼠PVN由谷氨酸脫羧酶參與的交感神經(jīng)抑制作用是否發(fā)生改變，其內(nèi)在機制如何尚未見相關(guān)報道，有必要進行深入研究，以探尋防治慢性心力衰竭的新策略和新方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

Wistar大鼠，雄性，體重180～200g，購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司。

1.2 藥品試劑與實驗設(shè)備

烯丙基甘氨酸、烏拉坦、α-氯醛糖、滂胺天藍購于Sigma-Aldrich公司；肝鈉素購于北京鼎國生物技術(shù)公司；多道生理記錄儀、大鼠腦立體定位儀、微操縱器等。

1.3 構(gòu)建慢性心衰大鼠模型

慢性心衰大鼠模型由結(jié)扎大鼠冠狀動脈左旋降支方法誘導，首先采用乙醚吸入法麻醉大鼠，然后將其在手術(shù)臺上仰位固定，自左側(cè)4～5肋間用彎頭止血鉗撐開胸廓，剪開心包膜暴露心臟，于肺動脈圓錐及左心房間找出冠狀動脈左旋降支，以帶線縫合針快速穿線結(jié)扎冠狀動脈左旋降支，結(jié)扎后，見心臟缺血區(qū)顏色變化后，將心臟迅速恢復于胸腔中，并排出胸腔內(nèi)積液和氣體，立即關(guān)閉胸腔，開胸后結(jié)扎冠脈步驟在30秒內(nèi)完成。假手術(shù)組只穿線，不結(jié)扎冠脈。結(jié)扎術(shù)后鄰近的前3天，肌肉內(nèi)注射青霉素，結(jié)扎術(shù)后第6～8周對假手術(shù)大鼠與心衰大鼠進行數(shù)據(jù)檢測。

1.4 實驗分組：

動物隨機分為兩大組：假手術(shù)組（n=8）和心衰組（n=8），每組動物分別在下丘腦室旁核微量注射不同劑量谷氨酸脫羧酶抑制劑烯丙基甘氨酸。

1.5 血流動力學指標觀察及腎交感神經(jīng)放電活動記錄

大鼠采用α-氯醛糖（70mg·kg-1）和烏拉坦（0.75g·kg-1）腹腔注射麻醉，分離右側(cè)頸總動脈，并用PE50管插管，另一端通過壓力換能器連于多道生理記錄儀上，同步采集血流動力學各項指標，首先記錄左心室舒張末期壓（LVEDP），后將PE50導管退出左心室，連續(xù)記錄動脈血壓及標Ⅱ?qū)?lián)心電圖，同步算出心率。腎交感神經(jīng)的分離及其放電活動的記錄方法詳細步驟參見文獻[4-5]。

1.6 下丘腦室旁核核團定位及微量注射

大鼠俯臥位固定于腦立體定位儀，并參照Paxions&Waston大鼠腦圖譜[11]，在下丘腦PVN（前囪后1.8 mm，L和R 0.4 mm，H=7.8mm）微量注射200納升（nl）相同體積的溶劑（Vehicle）人工腦脊液（pH=7.4），并先后分別微量注射200nl不同劑量的谷氨酸脫羧酶抑制劑烯丙基甘氨酸，從每次注射完成后開始計時，連續(xù)觀察心率、血壓和腎交感神經(jīng)放電對微量注射藥物或人工腦脊液的反應，每次給藥時間間隔30min。微注射實驗完畢，用過量麻醉劑將動物處死。將體積為50 nl、濃度為2%的滂胺天藍溶液緩慢注入下丘腦PVN。剪斷大鼠頭顱，去除顱骨，在4%多聚甲醛溶液中固定腦組織，3天后作冰凍切片（厚度為30μm），中性紅染色，在體視顯微鏡下觀察藥物是否進入下丘腦室旁核，定位偏離PVN者不列入統(tǒng)計。

1.7 檢測大鼠左心室心肌梗死面積

急性動物實驗結(jié)束后迅速將大鼠心臟從胸腔中取出，并轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱中保存。心肌梗死面積檢測的具體方法與參考文獻報道一致[12]。

1.8 大鼠PVN組織取材

用過量麻醉劑將假手術(shù)組和心衰組大鼠處死，取腦并迅速轉(zhuǎn)移至干冰上冰凍。用冰凍切片機在PVN核團所在位置連續(xù)切6張100μm厚的腦片，用12號針頭在腦片上PVN核團所在位置雙側(cè)總共打12個孔。針頭內(nèi)的組織即為PVN核團組織。

1.9 Western bolt檢測

取假手術(shù)組和心衰組大鼠PVN內(nèi)腦組織分別加入蛋白提取緩沖液（10 mMTris，1mMEDTA，1%SDS，0.1%Triton X-100和1 mMPMSF），超聲粉碎，37℃孵育30 min；4℃13000×g離心2min；上清液即為全細胞蛋白，Bradford法測定蛋白濃度；各組等量蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，三明治法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜；封閉液（含5%脫脂奶粉TBST）室溫封閉；分別用一抗谷氨酸脫羧酶GAD65和GAD67抗體（1∶500，rabbit polyclonal），GAPDH（1∶1000），室溫和4℃孵育過夜后，膜用TBST洗滌干凈。然后用1∶4000稀釋的紅外熒光標記二抗（Alexa Fluor 800或Alexa Fluor 700）分別對膜避光孵育1小時，Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)對膜上蛋白進行檢測。

1.10 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 心衰組與假手術(shù)組大鼠血流動力學等各項生理學指標檢測結(jié)果

對大鼠整體及其離體器官進行檢測發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，心衰組大鼠心臟重量、體重和肺濕重顯著增加（P<0.05），結(jié)果提示心衰大鼠有水潴留以及肺淤血跡象。其次，心衰組大鼠左心室心肌梗死面積較假手術(shù)組明顯增加（P<0.05），心衰組大鼠左心室心肌梗死面積在30%～40%之間，而假手術(shù)組大鼠左心室心肌未發(fā)生梗死。對大鼠血液動力學指標檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，心衰組大鼠左心室最大收縮舒張速率（±dp/dt）明顯下降；而心衰組大鼠左室舒張末期壓（LVEDP）卻顯著升高（P<0.05）（表1）；以上結(jié)果表明心衰大鼠心臟功能顯著下降，該表現(xiàn)類似于臨床慢性心衰癥狀。

表1 比較心衰組與假手術(shù)組大鼠血流動力學等各項生理學指標

2.2 注射谷氨酸脫羧酶抑制劑烯丙基甘氨酸

與溶劑對照組相比，假手術(shù)組和心衰組大鼠PVN內(nèi)微量注射谷氨酸脫羧酶抑制劑烯丙基甘氨酸導致心率、血壓和腎交感神經(jīng)放電呈劑量依賴性升高（P<0.05），但與假手術(shù)組相比，心衰組心率、血壓和腎交感神經(jīng)放電升高幅度顯著減?。≒<0.05）（圖1、圖2和圖3）。心率、血壓和腎交感神經(jīng)放電對烯丙基甘氨酸開始反應的時間是2～3min，微量注射烯丙基甘氨酸4.5～5.5 min內(nèi)各項指標的峰值出現(xiàn)，而在室旁核微量注射烯丙基甘氨酸20～25min內(nèi)，各項指標恢復至給藥前基線水平，并且心衰組大鼠心率、血壓和腎交感神經(jīng)放電的恢復時間為22.3±1.6 min，與假手術(shù)組恢復時間23.1±1.8min無顯著差異（P>0.05）。

圖1 下丘腦室旁核微量注射烯丙基甘氨酸對心率的影響

圖2 下丘腦室旁核微量注射烯丙基甘氨酸對血壓的影響

圖3 下丘腦室旁核微量注射烯丙基甘氨酸對腎交感神經(jīng)放電活動的影響

2.3 檢測大鼠PVN內(nèi)谷氨酸脫羧酶GAD65和GAD67蛋白表達量

因為谷氨酸脫羧酶分為谷氨酸脫羧酶GAD65和GAD67兩種亞型，故分別在6只假手術(shù)組和6只心衰組大鼠中，使用Western bolt技術(shù)檢測假手術(shù)組、心衰組大鼠PVN內(nèi)谷氨酸脫羧酶GAD65和GAD67亞型蛋白表達量。研究結(jié)果顯示與假手術(shù)組相比，心衰組大鼠PVN內(nèi)谷氨酸脫羧酶GAD65亞型蛋白表達量未發(fā)生顯著改變（P>0.05）（圖4），然而心衰組大鼠PVN內(nèi)谷氨酸脫羧酶GAD67亞型蛋白表達量顯著下調(diào)（P<0.05）（圖5）。

圖4 假手術(shù)組與心衰組大鼠下丘腦室旁核谷氨酸脫羧酶GAD65亞型蛋白表達量

圖5 假手術(shù)組與心衰組大鼠下丘腦室旁核谷氨酸脫羧酶GAD67亞型蛋白表達量

3 討論

本項研究工作證實心衰大鼠PVN內(nèi)谷氨酸脫羧酶參與的交感緊張性調(diào)節(jié)作用減弱。在大鼠PVN微量注射谷氨酸脫羧酶抑制劑烯丙基甘氨酸，引起心率加快、血壓升高和腎交感神經(jīng)放電增加，這可能是與微量注射谷氨酸脫羧酶抑制劑烯丙基甘氨酸后，交感神經(jīng)的傳出活動的去抑制有關(guān)。值得注意的是與假手術(shù)組比，心衰組PVN微量注射谷氨酸脫羧酶抑制劑后心率、血壓和腎交感神經(jīng)放電升高幅度顯著降低，結(jié)果提示心衰大鼠PVN的谷氨酸脫羧酶參與的緊張抑制作用發(fā)生鈍化。這種PVN的谷氨酸脫羧酶參與的交感縮血管緊張抑制作用的功能減弱可能是心衰的交感神經(jīng)興奮性增強作用機制之一。

然而，心衰大鼠PVN內(nèi)谷氨酸脫羧酶功能衰減的明確機制還不十分清楚。為進一步揭示其內(nèi)在作用機制，Western blot結(jié)果提示心衰大鼠PVN的谷氨酸脫羧酶參與的緊張性抑制作用發(fā)生鈍化，與谷氨酸脫羧酶67亞型的表達量下調(diào)有關(guān)，該結(jié)果與康玉明等人的報道相一致[10]。此外，仍存在下述幾種導致心衰大鼠室旁核谷氨酸脫羧酶功能衰減的可能機制：（1）突觸前γ-氨基丁酸合成或釋放的減少以及γ-氨基丁酸降解的增加與谷氨酸脫羧酶功能改變密切相關(guān)，從而導致交感神經(jīng)興奮亢進。（2）大鼠室旁核內(nèi)谷氨酸脫羧酶磷酸化和去磷酸化水平的改變。（3）大鼠室旁核內(nèi)不同種類激素或神經(jīng)遞質(zhì)合成水平的失衡。

大鼠神經(jīng)核團立體定位切片鑒定結(jié)果提示，室旁核內(nèi)微量注射谷氨酸脫羧酶抑制劑導致腎交感神經(jīng)放電、血壓和心率的增加為室旁核內(nèi)特異性反應，即注射時的酸堿化學刺激或機械刺激不能影響腎交感神經(jīng)放電、血壓和心率的變化，因為在室旁核內(nèi)微量注射pH為7.4的相同體積溶劑人工腦脊液，腎交感神經(jīng)放電、血壓和心率均未見顯著改變。進一步于室旁核鄰近部位微量注射相同PH值和體積的谷氨酸脫羧酶抑制劑，腎交感神經(jīng)放電、血壓和心率亦未發(fā)生明顯變化，結(jié)果提示室旁核內(nèi)微量注射谷氨酸脫羧酶抑制劑引起的特異性反應并非由藥物擴散到室旁核鄰近部位所引發(fā)；此外，靜脈注射2.5倍于室旁核微量注射最高劑量的谷氨酸脫羧酶抑制劑未導致腎交感神經(jīng)放電、血壓和心率發(fā)生明顯變化，結(jié)果提示室旁核內(nèi)微量注射谷氨酸脫羧酶抑制劑引起的特異性反應與藥物進入血液循環(huán)作用于其它外周組織器官無關(guān)。

綜上所述，本研究顯示慢性心衰狀態(tài)下PVN內(nèi)谷氨酸脫羧酶參與的交感傳出抑制作用發(fā)生鈍化與谷氨酸脫羧酶的表達量下調(diào)有關(guān)，結(jié)果提示PVN內(nèi)谷氨酸脫羧酶功能的減弱和谷氨酸脫羧酶的表達量下調(diào)是心衰狀態(tài)下心血管功能異常（如交感興奮性增強等）的重要病理機制之一。

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