余 蕾， 張曉蓉， 鄧 婕

1四川省自貢市第四人民醫(yī)院口腔科，自貢643000

2昆明醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院正畸科，昆明650031

骨性上頜前突不僅影響口腔健康、功能、面部美觀，而且隨著生長發(fā)育，畸形可能會(huì)逐漸加重，對(duì)患者的生活和社交均產(chǎn)生負(fù)面影響，甚至導(dǎo)致心理疾患。對(duì)于早期骨性上頜前突，有效地后牽引抑制過度生長的上頜骨是獲得最佳正畸療效的關(guān)鍵之一［1］。目前，臨床上治療骨性上頜前突的方法主要是利用頭帽口外弓，但其療效依賴患者的合作［2］。近年來，種植體技術(shù)的迅猛發(fā)展，種植體被作為較理想的支抗裝置引入正畸臨床。目前，將種植體作為矯形支抗的研究多數(shù)集中在前牽引上頜骨和腭中縫開展上，針對(duì)后牽引上頜骨抑制其生長的研究還很少。Sheridan等［3］認(rèn)為頜骨的矯形治療中，矯形力主要通過調(diào)控顱面復(fù)合體的骨縫生長來影響骨改建。Mao等［4－5］研究發(fā)現(xiàn)骨縫反應(yīng)是以幾個(gè)組織學(xué)變化為特征，包括：骨縫寬度的變化、骨縫區(qū)細(xì)胞密度的變化和骨縫成骨前沿的骨生成，而其中的骨縫寬度變化最為重要。本實(shí)驗(yàn)通過定量分析骨縫寬度和細(xì)胞密度的變化，研究后牽引力作用下上頜骨相關(guān)骨縫反應(yīng)，深入探討種植體支抗后牽引抑制上頜骨生長的矯形作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料

云南產(chǎn)青春生長發(fā)育期（約3歲，按照Hellmen牙齡的劃分，牙齡為ⅢA～ⅢB，牙列完整、牙周健康）、雄性、SPF級(jí)（清潔級(jí)，即無特定病原體動(dòng)物）恒河猴4只；顴骨種植體支抗系統(tǒng)（慈北公司，浙江）；牙弓夾板（家鴻齒科，昆明）；Motic Med 6．0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像采集系統(tǒng)（MOTIC公司，Japan）；Image Pro Plus 6．0圖像分析系統(tǒng)（Media Cybernetics公司，USA）；玻璃離子（3MUntitek公司，USA）；梯度乙醇、EDTA、4%多聚甲醛、二甲苯、蘇木精和伊紅。

1．2 方法

1．2．1 動(dòng)物模型的建立 肌注復(fù)合型氯胺酮（0．1 mg／kg）麻醉恒河猴，在上頜第一磨牙遠(yuǎn)中根方前庭溝作垂直切口，依次切開黏膜、肌肉和骨膜，剝離骨膜并暴露顴骨，用引導(dǎo)鉆鉆開骨皮質(zhì)，將鈦板植入，用3枚微螺釘固定在顴骨體部，分層縫合肌肉和黏膜，將鈦板末端牽引鉤暴露于前庭溝底部。按照鑄造冠備牙要求進(jìn)行牙體預(yù)備，去除上頜第一恒磨牙、第二乳磨牙及切牙牙體倒凹，牙弓夾板試戴后，采用玻璃離子粘接于上頜牙弓。Ni－Ti螺旋拉簧一端結(jié)扎固定在種植體末端拉鉤上，另一端通過結(jié)扎絲與牙弓夾板上的牽引鉤結(jié)扎；用正畸測力計(jì)測量拉簧力值，使單側(cè)拉簧產(chǎn)生150g牽引力，雙側(cè)共計(jì)300 g，力的方向與 平面平行（圖1）。

圖1 動(dòng)物模型的建立Fig．1 Establishment of the animal model

1．2．2 骨縫標(biāo)本的制備和染色 分別于實(shí)驗(yàn)1．5個(gè)月、3個(gè)月肌注氯胺酮麻醉后，4%多聚甲醛（PFA）行雙側(cè)頸總動(dòng)脈灌注、固定、股動(dòng)脈放血處死實(shí)驗(yàn)猴3只、對(duì)照猴1只。動(dòng)物處死后，取下完整顱骨標(biāo)本，去除腦組織。采用4%多聚甲醛進(jìn)行24h固定后，取出標(biāo)本。將各骨縫：顴顳縫、顴頜縫、顴額縫、額頜縫、蝶顴縫、翼腭縫、腭中縫、橫腭縫分別游離，采用甲酸脫鈣1個(gè)月左右，至針尖可以刺破骨皮質(zhì)，終止脫鈣。自來水24h漂洗過夜，梯度乙醇慢脫水，氯仿透明，浸蠟，常規(guī)石蠟包埋，與骨縫界面垂直做連續(xù)切片，片厚4μm，裱于經(jīng)多聚氨酸（Poly－L－Lysine）處理的載玻片上。從切到骨縫組織開始，對(duì)切片進(jìn)行連續(xù)編號(hào)，每個(gè)標(biāo)本選擇相同編號(hào)且連續(xù)的5張切片進(jìn)行組織學(xué)染色。常規(guī)蘇木精－伊紅染色，中性樹脂封片。

1．2．3 圖像的采集和分析 應(yīng)用 Motic Med 6．0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像采集系統(tǒng)對(duì)圖像進(jìn)行觀察并采集圖像。同時(shí)使用Image Pro Plus 6．0圖像分析系統(tǒng)對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各階段的骨縫寬度進(jìn)行研究。40倍放大的圖像，在觀察視野內(nèi)的骨縫上畫圓，使每個(gè)圓的直徑與骨縫寬度相等（圖2），通過測量圓的直徑可得到骨縫寬度。在100倍放大并且有標(biāo)準(zhǔn)格（110μm×110μm）的圖像上隨機(jī)選擇6個(gè)包含骨縫區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)格，對(duì)其內(nèi)符合條件的細(xì)胞計(jì)數(shù)（圖3），總的細(xì)胞密度用單位面積的細(xì)胞數(shù)表示（cells／mm2）。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)由SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件處理，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。

圖2 骨縫寬度的測量（蘇木精－伊紅染色，×40）Fig．2 Measurement of the width of suture（HE staining，×40）

圖3 細(xì)胞密度的測量（蘇木精－伊紅染色，×100）Fig．3 Measurement of cell density（HE staining，×100）

2 結(jié)果

2．1 骨縫寬度

觀察對(duì)照組、1．5月組和3月組各骨縫寬度直條圖（圖4）可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)前后上頜骨周圍各骨縫寬度均發(fā)生了不同程度的變化：在后牽引力作用下，顴顳縫、顴頜縫、橫腭縫和翼腭縫骨縫寬度隨著加力時(shí)間延長逐漸減小，其中，顴顳縫和翼腭縫1．5月組明顯減小。額頜縫、顴額縫、腭中縫和蝶顴縫骨縫寬度隨著加力時(shí)間延長逐漸增加，其中，顴額縫、額頜縫和蝶顴縫3月組明顯增加。

圖4 各組骨縫寬度Fig．4 The width of suture in different groups

若要進(jìn)一步分析這種差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，還需行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。經(jīng)檢驗(yàn)，表1所示數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，故可進(jìn)行方差分析。對(duì)照組、1．5月組、3月組經(jīng)分析后，確定檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0．05，由于均P＜0．05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所以可認(rèn)為對(duì)照組、1．5月組、3月組骨縫寬度總體上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。要比較具體兩組間存在的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，還需進(jìn)行兩兩比較。研究結(jié)果如表1所示，3月組和對(duì)照組相比，各骨縫寬度變化均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在寬度減小的4條骨縫中，顴顳縫和翼腭縫1．5月組寬度明顯減小，但是與3月組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而在寬度增大的4條骨縫中，額頜縫和蝶顴縫3月組寬度明顯增大，與對(duì)照組、1．5組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是對(duì)照組和1．5月組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2．2 細(xì)胞密度

通過對(duì)照組、1．5月組和3月組各骨縫細(xì)胞密度直條圖（圖5）的觀察可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)前后各骨縫區(qū)細(xì)胞密度均發(fā)生了不同程度的變化：在后牽引力作用下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞密度均大于對(duì)照組。其中，額頜縫、顴額縫、腭中縫和蝶顴縫細(xì)胞密度3月組大于1．5月組；而顴顳縫、顴頜縫、橫腭縫和翼腭縫細(xì)胞密度1．5月組大于3月組。

表1 3組間骨縫寬度比較（±s，μm）Table 1 Comparison of the width of suture among three groups（±s，μm）

表1 3組間骨縫寬度比較（±s，μm）Table 1 Comparison of the width of suture among three groups（±s，μm）

與對(duì)照組比較，＊P＜0．05；與1．5月組比較，△P＜0．05

組別 額頜縫 顴額縫 顴顳縫 顴頜縫 橫腭縫 腭中縫 翼腭縫 蝶顴縫．00 42．92±5．61 1．5月組 53．18±16．54 80．26±25．40＊ 73．51±30．37＊ 81．23±59．58＊ 72．02±20．66＊ 100．17±114．03＊ 53．43±12．15＊ 62．79±22．16＊3月組 197．01±55．96＊△197．01±55．96＊△ 66．24±14．61＊ 41．59±10．09＊△ 42．30±20．22＊△157．23±36．19＊△ 51．35±16．72＊ 195．04±72．15對(duì)照組 48．53±15．03 59．31±17．28 198．58±30．03 113．16±35．12 106．00±34．68 46．68±13．79 187．00±42＊△

圖5 各組細(xì)胞密度Fig．5 Cell density in different groups

進(jìn)一步對(duì)差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，1．5月組和對(duì)照組比較，所有骨縫細(xì)胞密度均增大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；3月組和1．5月組比較，顴頜縫和翼腭縫細(xì)胞密度減小，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，額頜縫和腭中縫細(xì)胞密度增大，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；3月組和對(duì)照組比較，顴顳縫細(xì)胞密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

骨縫定量一直是學(xué)界難點(diǎn)，不僅因其自身結(jié)構(gòu)復(fù)雜（骨的幾何形狀、骨縫走行方向和骨縫位置），還受技術(shù)限制。傳統(tǒng)方法是在骨縫的某個(gè)特定區(qū)域兩側(cè)各植入一顆汞合金以評(píng)估骨縫寬度的變化［6－7］。但是，骨縫自身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性決定了骨縫寬度在不同區(qū)域不是線性的［8－9］。計(jì)算機(jī)技術(shù)的飛速發(fā)展給定量分析帶來了新的希望。有國外學(xué)者［10－12］率先利用計(jì)算機(jī)組織形態(tài)學(xué)技術(shù)定量分析了間斷循環(huán)張應(yīng)力和壓應(yīng)力作用下的骨縫反應(yīng)。最初，他們采用在分析圖片上建立一定大小的標(biāo)準(zhǔn)格將骨縫分割成若干個(gè)小的區(qū)域，再畫圓，以圓的直徑代表骨縫寬度，同時(shí)使圓的直徑位于所建立的標(biāo)準(zhǔn)格的橫軸或縱軸上。此方法為骨縫寬度的測量開拓了全新的模式，但也有明顯的不足，即當(dāng)骨縫的走行呈一定角度時(shí)圓的直徑不一定能位于坐標(biāo)軸上。隨后，學(xué)者們進(jìn)行了改進(jìn)［13］：保留標(biāo)準(zhǔn)格和圓，同樣以圓的直徑代表骨縫寬度，但是不將直徑放在坐標(biāo)軸上，而是讓圓位于標(biāo)準(zhǔn)格內(nèi)。此舉確實(shí)解決了因骨縫走行的差異而影響準(zhǔn)確性的問題，但是要保證圓既完全位于標(biāo)準(zhǔn)格內(nèi)又能代表骨縫寬度，那么符合這一要求的圓的數(shù)量將明顯減少。建立標(biāo)準(zhǔn)格的目的是為了將走行不規(guī)則的骨縫劃分成若干個(gè)小區(qū)域?qū)崿F(xiàn)定量分析。標(biāo)準(zhǔn)格太大或太小都不能畫出足夠多滿足條件的圓，不能實(shí)現(xiàn)定量。而本課題研究的8條骨縫因其各自的復(fù)雜性使同時(shí)適應(yīng)于所有骨縫的標(biāo)準(zhǔn)格很難建立，而且定量的關(guān)鍵是要有足夠的測量單元。所以在考慮了以上各種因素后，本研究舍棄標(biāo)準(zhǔn)格直接畫圓來代表骨縫寬度，以保證圓的直徑即骨縫寬度，同時(shí)不受骨縫走行和標(biāo)準(zhǔn)格大小的影響，更重要的是有足夠的測量單元以實(shí)現(xiàn)定量分析。此法為骨縫定量分析開拓了全新的思路。

細(xì)胞密度的定量分析也可采用計(jì)算機(jī)組織形態(tài)學(xué)技術(shù)。國內(nèi)方面，吳拓江等［14］在200倍放大的顯微圖像上隨機(jī)選擇3個(gè)視野，在定好的參數(shù)下測量頜間Ⅲ類矯形力作用下骨縫區(qū)細(xì)胞密度。該方法在測量視野、細(xì)胞種類的選擇上存在不足。國外學(xué)者［10－12］則在已經(jīng)建立有110μm×110μm標(biāo)準(zhǔn)格的20倍放大的顯微圖像上，隨機(jī)選擇6個(gè)包含骨縫區(qū)的標(biāo)準(zhǔn)格，對(duì)其內(nèi)符合條件的細(xì)胞計(jì)數(shù)，即只計(jì)數(shù)骨縫內(nèi)的非暫時(shí)性細(xì)胞，而非骨縫兩端成骨前沿內(nèi)細(xì)胞和血管內(nèi)細(xì)胞如紅細(xì)胞等一過性的細(xì)胞，定量分析了循環(huán)張應(yīng)力和壓應(yīng)力作用下鼻額縫和前上頜縫骨縫細(xì)胞密度的變化。本研究采用國外學(xué)者的方法對(duì)8條骨縫細(xì)胞密度進(jìn)行定量分析。

本研究發(fā)現(xiàn)，在后牽引力作用下，上頜骨周圍的4條骨縫中，顴頜縫、翼腭縫和橫腭縫骨縫寬度減小，呈壓縮狀態(tài)，提示上頜骨向后壓縮。其中，顴頜縫作為上頜骨和顱骨連接面積最大、骨質(zhì)最致密處，矯形力并非垂直，故其反應(yīng)非常復(fù)雜，張強(qiáng)等［15］利用三維有限元法分析后也發(fā)現(xiàn)，顴頜縫上方（內(nèi)、外側(cè)）的拉應(yīng)力較大，顴頜縫下方（內(nèi)、外側(cè)）的壓應(yīng)力較大。本研究中其寬度減小，可能是矯形力作用下上方牽引形變?nèi)跤谙路綁嚎s形變的結(jié)果。而位于上頜骨上部的額頜縫寬度增大，呈牽張狀態(tài)，提示上頜骨同時(shí)伴順時(shí)針旋轉(zhuǎn)。這與Tanne等［16］采用三維有限元法研究在 平面向后牽引時(shí)鼻上頜復(fù)合體呈順時(shí)針旋轉(zhuǎn)的結(jié)論一致。但張曉蓉等［17］觀察發(fā)現(xiàn)額頜縫呈吸收為主的骨縫反應(yīng)。這可能是因?yàn)轭~頜縫結(jié)構(gòu)復(fù)雜，部分呈現(xiàn)壓縮，部分呈現(xiàn)牽張，但總體表現(xiàn)為牽張。張強(qiáng)等［15］也證實(shí)后牽引角度由＋30°～－30°，額頜縫應(yīng)力分布均以拉應(yīng)力為主。

作為種植體承載骨，顴骨周圍的3條骨縫中，顴顳縫骨縫寬度減小，呈壓縮效應(yīng)；顴額縫、蝶顴縫寬度增大，呈牽張效應(yīng)，提示顴骨具有一定的旋轉(zhuǎn)趨勢。這也是種植體支抗與口外弓抑制上頜骨生長不同之處，口外弓使上頜骨向前、向下的生長受到抑制，使下頜向前的生長受到促進(jìn)，但是對(duì)于顴骨沒有明顯的影響［18］。此外，前期研究［17］指出顴骨周圍的骨縫均呈現(xiàn)牽張拉伸狀態(tài)。這可能與骨縫反應(yīng)的復(fù)雜性及觀察視野差異有關(guān)，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

本研究發(fā)現(xiàn)腭中縫寬度增加，呈牽張狀態(tài)，且隨著時(shí)間延長效果更為明顯。但張強(qiáng)等［19］研究發(fā)現(xiàn)向后牽引角度為＋30°、0°、－30°時(shí)在腭中縫前、中、后部的位移方向都是壓迫。本研究采用的是與 平面平行，但與正中矢狀面有一定夾角的牽引力（圖6A）。牽引方向不同可能使骨縫同一部位出現(xiàn)不同的應(yīng)變反應(yīng)，骨縫寬度也出現(xiàn)差異。值得注意的是，張強(qiáng)等采用的是與正中矢狀面平行向后的牽引力（圖6B），力作用線近似平行，對(duì)于腭中縫而言就相當(dāng)于骨折治療中采用的夾板作用，限制了腭部的橫向擴(kuò)展；而本研究采用的力與正中矢狀面形成了一定夾角，即從前段牙弓向后段牙弓呈現(xiàn)出外展的趨勢，給予腭中縫從前向后不斷加大的橫向擴(kuò)弓效應(yīng)。

圖6 與正中矢狀面夾角不同的后牽引力Fig．6 Retractive force of different angles with the median sagittal plane

本研究發(fā)現(xiàn)8條骨縫細(xì)胞密度均為實(shí)驗(yàn)組大于對(duì)照組，可能由于應(yīng)力作用下骨縫間質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞增殖率增加或（和）凋亡率降低。現(xiàn)有研究亦發(fā)現(xiàn)骨縫區(qū)細(xì)胞密度的增加主要?dú)w因于間充質(zhì)細(xì)胞的增加，而這一結(jié)果也已被間充質(zhì)細(xì)胞對(duì)于機(jī)械應(yīng)力的反應(yīng)所證實(shí)［20］。從開始發(fā)育到成熟，骨縫均由5層結(jié)構(gòu)加內(nèi)外2層骨膜構(gòu)成。壓應(yīng)力使5層結(jié)構(gòu)受到不同程度的損傷，增生活躍的成骨細(xì)胞層最易受損進(jìn)而變性，力量越大、時(shí)間越長變性越嚴(yán)重，因此總細(xì)胞活力明顯下降甚至停止［21］。所以，1．5月組各骨縫細(xì)胞密度均增大，但隨著牽引時(shí)間的延長，顴頜縫、翼腭縫、橫腭縫和顴顳縫細(xì)胞密度減小，即3月組＜1．5月組，總體上呈現(xiàn)出一種受壓縮的趨勢。與此相反，張應(yīng)力激活敏感細(xì)胞，細(xì)胞密度增加，此后隨著作用時(shí)間延長，細(xì)胞繼續(xù)增殖。所以，隨著牽引時(shí)間的延長，顴額縫、蝶顴縫、額頜縫和腭中縫細(xì)胞密度增大，即1．5月組＜3月組，總體上呈現(xiàn)出一種受牽張的趨勢，與骨縫寬度的變化一致。

此外，后牽引力作用下細(xì)胞密度變化具有一定時(shí)間差異。顴頜縫、翼腭縫、額頜縫和腭中縫在1．5月組和3月組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并不表示這4條骨縫未受到矯形力作用。相反，可能由于這些骨縫早期就在矯形力的作用下而積極改建，細(xì)胞的增殖、分化和凋亡很快適應(yīng)矯形力而達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。顴顳縫在對(duì)照組和3月組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能的原因是持續(xù)壓應(yīng)力作用下，成骨和成纖維細(xì)胞大量受到抑制，合成細(xì)胞因子明顯減少、甚至停止，破骨細(xì)胞激活明顯減少、甚至停止，總的細(xì)胞密度明顯減小，與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，顴額縫、橫腭縫細(xì)胞密度和骨縫寬度對(duì)照組、1．5月組和3月組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明其細(xì)胞密度變化與骨縫寬度變化高度一致。翼腭縫細(xì)胞密度和骨縫寬度1．5月組和3月組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明在后牽引力作用下，早期骨縫就發(fā)生積極改建達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。

綜上所述，在顴骨種植體支抗后牽引矯形力作用下，上頜骨有向后壓縮并伴順時(shí)針旋轉(zhuǎn)趨勢；顴骨作為支抗承載骨也有一定的旋轉(zhuǎn)趨勢。與正中矢狀面有一定夾角的后牽引力對(duì)上頜腭中縫有橫向擴(kuò)弓的效應(yīng)。

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