吳曉輝， 陶裕川， 汪 峰， 黃 琴， 鄧金木， 王志剛， 程 遠(yuǎn)△

重慶醫(yī)科大學(xué)1附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科2超聲影像研究所，重慶400010

凋亡及凋亡抵抗是腫瘤形成的基礎(chǔ)，同時(shí)也成為腫瘤靶點(diǎn)治療的策略之一。腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，手術(shù)、放化療治療均難以達(dá)到根除，復(fù)發(fā)率極高［1］。與其他惡性腫瘤一樣，腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡機(jī)制失常有關(guān)［2－3］。在適當(dāng)?shù)某晠?shù)條件下，低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡的聲空化效應(yīng)能夠改變細(xì)胞膜的膜質(zhì)結(jié)構(gòu)、增強(qiáng)其滲透性、促進(jìn)基因轉(zhuǎn)染和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，顯示出其在無創(chuàng)超聲外科中潛在的臨床應(yīng)用前景［4－5］。本實(shí)驗(yàn)采用低強(qiáng)度（低頻、低功率）超聲聯(lián)合微泡作用于體外大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，重點(diǎn)觀察了不同低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡對(duì)大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和凋亡的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料及主要試劑

大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（以下簡稱C6細(xì)胞）由重慶醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室惠贈(zèng)。四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國Sigma公司）、二甲基亞砜（DMSO，美國Ameresco公司），吖啶橙／溴化乙啶（AO／EB試劑盒上海百萃），AnnexinⅤ－FITC／PI試劑盒（深圳晶美公司）。SonoVue微泡，意大利BRACCO Imaging B．V．公司生產(chǎn)，上海博萊科信誼藥業(yè)有限責(zé)任公司提供。

1．2 實(shí)驗(yàn)儀器

低頻超聲治療儀：超聲探頭直徑2．5cm，長度10cm，頻率43kHz，功率為0．50～2．75W／cm2，共6檔、全自動(dòng)酶標(biāo)儀（奧地利TECAN公司）、FACSort流式細(xì)胞儀（美國B＆D公司）、透射電鏡（日本HITACHI公司 H－7500型）、掃描電鏡（日本 HITACHI公司S3000N型）、倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）。

1．3 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為空白組（加入完全培養(yǎng)液，不加入細(xì)胞，不用超聲處理）、對(duì)照組（加入完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，以與輻照組同樣的細(xì)胞密度、水溫和時(shí)間予以對(duì)照）和不同超聲劑量組（0．1、0．3、0．5、0．7、1．0、1．5 W／cm2）。微泡劑量（SonoVue）15μL／mL；觀察時(shí)間0、6、12、24、48h。

1．4 實(shí)驗(yàn)方法

1．4．1 C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 將C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)，分組實(shí)驗(yàn)。

1．4．2 超聲輻照C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞 探頭固定于盛脫氣水質(zhì)容器底部，實(shí)驗(yàn)水溫37℃，將盛有處于對(duì)數(shù)生長期C6細(xì)胞的96孔板垂直固定于探頭正上方，微泡劑量（SonoVue）15μL／mL，距探頭1cm，超聲頻率43kHz，持續(xù)輻照時(shí)間1min。

1．4．3 MTT比色法檢測各功率、各時(shí)間段抑瘤率初步確定實(shí)驗(yàn)參數(shù) 取對(duì)數(shù)生長期C6細(xì)胞，錐蟲藍(lán)活細(xì)胞拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞90%以上，用RPMI 1640完全培養(yǎng)液配制成3×104／mL細(xì)胞懸液，以200 μL／孔接種于96孔培養(yǎng)板，每塊培養(yǎng)板接種20個(gè)平行孔，共40塊。每組5塊培養(yǎng)板。輻照后繼續(xù)培養(yǎng)0、6、12、24、48h。在上述時(shí)間點(diǎn)取出培養(yǎng)板，每孔加入 MTT 20μL（5mg／mL），培養(yǎng)箱中孵育4h，棄去上清，每孔加入200μL DMSO，振蕩15min，檢測波長570nm的全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測各組C6細(xì)胞的吸光度值（A值）和標(biāo)準(zhǔn)差。抑瘤率公式：抑瘤率（%）＝1－實(shí)驗(yàn)組A值／空白組A值×100%。

1．4．4 AO／EB雙染免疫熒光鑒別凋亡／壞死／活細(xì)胞 將細(xì)胞懸液以每孔200μL接種于96孔培養(yǎng)板，每塊培養(yǎng)板接種20個(gè)平行孔。超聲處理后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)6h，PBS洗滌2次，將100μg／mL的吖啶橙和溴化乙啶熒光染液按1∶1比例混勻，按照1．5×104個(gè)細(xì)胞／μL的比例與培養(yǎng)細(xì)胞混勻。在熒光顯微鏡下510nm激發(fā)波長觀察和鑒別凋亡／壞死／活細(xì)胞形態(tài)、顏色變化。隨機(jī)計(jì)數(shù)4個(gè)視野，每視野200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞平均凋亡率和細(xì)胞平均壞死率。細(xì)胞平均凋亡率＝（凋亡早期細(xì)胞數(shù)＋凋亡晚期細(xì)胞數(shù)）／細(xì)胞總數(shù)×100%，細(xì)胞平均壞死率＝壞死細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)×100%。

1．4．5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率及細(xì)胞周期分布 取對(duì)數(shù)生長期C6細(xì)胞，消化離心，PBS洗滌2次，70%冰乙醇固定，制成5×106個(gè)／mL細(xì)胞懸液，加樣入流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡百分率及細(xì)胞周期分布，并計(jì)算凋亡增殖比（APR）：APR＝細(xì)胞凋亡率／細(xì)胞增殖構(gòu)成比（S＋G2／M期百分比）。

1．4．6 透射電鏡觀察細(xì)胞和細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)的改變 超聲處理后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)6h，消化、離心收集細(xì)胞，2．5%戊二醛－1%鋨酸雙固定、梯度乙醇脫水、包埋、切片及鈾－鉛雙染色、烘干，透射電鏡觀察、照像。

1．4．7 掃描電鏡觀察細(xì)胞膜超微結(jié)構(gòu)的改變 將C6細(xì)胞接種于內(nèi)鋪有2cm×2cm載玻片的6孔培養(yǎng)板，超聲處理后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)6h，取出有細(xì)胞爬片的載玻片，取PBS漂洗3次，然后固定、脫水，掃描電鏡觀察、照像。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 MTT法檢測低頻超聲對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

結(jié)果見表1，與對(duì)照組比較，超聲聯(lián)合微泡輻照各時(shí)間段C6細(xì)胞生長抑制率均呈明顯劑量依賴性；超聲輻照6h組細(xì)胞生長抑制率最高，其后隨時(shí)間逐漸下降，在實(shí)驗(yàn)6h時(shí)間段上，與0．1W／cm2組、0．3W／cm2組、0．5W／cm2組相比，0．7W ／cm2組、1．0W／cm2組、1．5W／cm2組對(duì) C6細(xì)胞增殖抑制率明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）；而0．7W／cm2組、1．0W／cm2組、1．5W／cm2組3組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。

表1 不同參數(shù)不同時(shí)間低頻超聲聯(lián)合微泡對(duì)C6細(xì)胞增殖的影響（±s）Table 1 Effects of low－frequency ultrasound with different parameters on C6cells growth at different time（±s）

表1 不同參數(shù)不同時(shí)間低頻超聲聯(lián)合微泡對(duì)C6細(xì)胞增殖的影響（±s）Table 1 Effects of low－frequency ultrasound with different parameters on C6cells growth at different time（±s）

與對(duì)照組比較，＊P＜0．05；與0．1W／cm2組、0．3W／cm2組、0．5W／cm2組比較，均▲P＜0．05

抑瘤率（%）組別5±0．32實(shí)驗(yàn)組0．1W／cm2 1．71±0．05＊ 18．43±0．18＊ 15．99±0．29＊ 13．16±0．17＊ 12．07±0．59＊0．3W／cm2 1．69±0．17＊ 16．79±0．16＊ 17．35±0．15＊ 11．09±0．20＊ 10．47±0．33＊0．5W／cm2 1．47±0．31＊ 19．27±0．00＊ 14．14±0．14＊ 12．04±0．74＊ 11．38±0．05＊0．7W／cm2 1．02±0．16＊ 34．19±0．17＊▲ 19．11±0．13＊ 18．27±0．82＊ 17．43±0．15＊1．0W／cm2 1．54±0．01＊ 37．82±0．16＊▲ 24．54±0．75＊ 18．75±0．51＊ 16．29±0．31＊1．5W／cm2 2．15±0．71＊ 39．19±0．22＊▲ 28．41±0．84＊ 19．55±0．19＊ 18．45±0．33 0h 6h 12h 24h 48h對(duì)照組 0．01±0．10 0．07±0．11 0．04±0．16 0．02±0．10 0．0＊

2．2 低頻超聲聯(lián)合微泡對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和壞死的影響

AO／EB熒光染色鑒別壞死／凋亡／活C6細(xì)胞，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞壞死率。結(jié)果表明：0．7 W／cm2組聯(lián)合微泡細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組和其它實(shí)驗(yàn)組，而細(xì)胞壞死率明顯低于1．0W／cm2組、1．5 W／cm2組。0．7W／cm2輻照組 C6細(xì)胞凋亡指數(shù)為（17．03±1．94）%，而對(duì)照組為（2．31±1．57）%，提示0．7W／cm2為最佳參數(shù)（圖1、2）。

2．3 低頻超聲聯(lián)合微泡對(duì)C6細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢查結(jié)果表明：與對(duì)照組比較，輻照組細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0．01）；并在正常二倍體細(xì)胞周期G0／G1峰前出現(xiàn)一個(gè)特征性的凋亡峰（AP）（圖3、4）。與對(duì)照組比較，輻照組細(xì)胞 G0／G1期百分比明顯升高，而S期、G2／M期、S＋G2／M期百分比（細(xì)胞增殖構(gòu)成比）降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）；輻照組APR與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。見表2。

上述結(jié)果顯示低頻超聲聯(lián)合微泡輻照后，①C6細(xì)胞生長阻滯于G1／S期，處于DNA復(fù)制和活動(dòng)的細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞增殖受到抑制；②細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞增殖率降低，提示低頻超聲可抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長。

2．4 TUNEL法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)照組正常細(xì)胞呈藍(lán)色、梭形排列，可見極少量的TUNEL染色陽性的棕黃色凋亡細(xì)胞呈單個(gè)散在分布（圖5A、5C）。輻照組正常細(xì)胞呈藍(lán)色、梭形排列，有少量的TUNEL染色陽性的棕黃色凋亡細(xì)胞（圖5B、5D）。

2．5 低頻超聲聯(lián)合微泡對(duì)C6細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電鏡下，對(duì)照組C6細(xì)胞邊界清楚、細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻，胞質(zhì)豐富，線粒體外形正常，內(nèi)膜嵴清晰可見，細(xì)胞器未見明顯損傷（圖6A）；凋亡組C6細(xì)胞可見到凋亡各階段的改變，早期核染色質(zhì)濃集形成半月形環(huán)貼近核膜，染色質(zhì)邊集（圖6B），繼而，細(xì)胞體積縮小、胞質(zhì)濃縮、細(xì)胞核濃聚縮小，染色質(zhì)進(jìn)一步固縮聚集于核膜下（圖6C），最后，細(xì)胞核表現(xiàn)為核固縮、核碎裂，可見胞膜包繞核碎片形成的凋亡小體（圖6D）。

圖1 低頻超聲對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和壞死的影響Fig．1 Effect of LIUS on the apoptosis and necrosis of C6glioma cells

表2 超聲聯(lián)合微泡治療后細(xì)胞周期相關(guān)參數(shù)（n＝10，±s）Table 2 Changes of cell cycle－related parameters after treatment with LIUS plus microbubbles（n＝10，±s）

表2 超聲聯(lián)合微泡治療后細(xì)胞周期相關(guān)參數(shù)（n＝10，±s）Table 2 Changes of cell cycle－related parameters after treatment with LIUS plus microbubbles（n＝10，±s）

與對(duì)照組比較，＊P＜0．05

組別 G0G1期 S期 G2M期 S＋G2M期APR對(duì)照組 56．48±1．23 29．83±2．67 23．69±1．48 41．33±3．17 0．03±1．51輻照組 78．73±2．34＊ 17．47±2．19＊ 3．80±2．76＊ 20．31±3．49＊ 0．64±3．14＊／／／

圖2 熒光顯微鏡觀察和鑒別凋亡／壞死／活C6細(xì)胞形態(tài)（×400）Fig．2 Morphological changes of apoptotic，necrotic and viable C6cells observed and identified by fluorescent microscopy（×400）

圖3 對(duì)照組G0／G1峰前未出現(xiàn)凋亡峰Fig．3 No appearance of the apoptosis peak before the G0／G1peak in control group

圖4 輻照組G0／G1峰前出現(xiàn)1個(gè)凋亡峰Fig．4 Appearance of the apoptosis peak before the G0／G1peak in irradiation group

圖5 TUNEL法觀察細(xì)胞凋亡情況Fig．5 Observation of cell apoptosis by TUNEL assay

2．6 掃描電鏡觀察

觀察到對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞膜表面有一些皺褶和微絨毛，細(xì)胞邊界清楚（圖7A）。輻照組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞膜有穿孔（圖7B），多孔融合等現(xiàn)象（圖7C）。

3 討論

低強(qiáng)度超聲波具有無創(chuàng)、靶向、聚焦和穿透性強(qiáng)等特點(diǎn)，越來越引起人們的重視與期待。近年研究表明低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡所產(chǎn)生的聲空化效應(yīng)不僅可以增強(qiáng)對(duì)離體活體細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的藥物導(dǎo)入、基因轉(zhuǎn)染，還可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，以及逆轉(zhuǎn)腫瘤對(duì)化療藥物的耐藥性［6－7］，但上述研究主要見于非神經(jīng)腫瘤細(xì)胞，如 HL－60、K562、U937、HeLa和 M／2等多種種類的腫瘤細(xì)胞，而針對(duì)神經(jīng)腫瘤的研究甚少。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)討論不同強(qiáng)度低頻超聲聯(lián)合微泡對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長、增殖和凋亡的影響。其結(jié)果表明：不同劑量低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡對(duì)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖均有抑制作用，且呈明顯的劑量依賴性，輻照后6h和12h增殖抑制作用最明顯。采用超聲頻率43kHz、輻照物距離探頭1 cm、微泡劑量為10μL／mL，輻照功率0．7W／cm2、持續(xù)輻照1min，處理后6h，C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡率高，而壞死率較低，此條件為本研究提供的低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋亡的最佳參數(shù)。當(dāng)輻照功率繼續(xù)增加時(shí)，雖然細(xì)胞凋亡率仍繼續(xù)增加，而細(xì)胞壞死率也明顯增加。其結(jié)果提示低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡干預(yù)后C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡率增加，細(xì)胞增殖指數(shù)下降，APR上調(diào)，這為腫瘤的治療提供了一種新的策略。最后，通過流式細(xì)胞儀和電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其典型凋亡變化過程和特征性電鏡改變，即染色質(zhì)邊集，細(xì)胞體積縮小、細(xì)胞核濃聚縮小，染色質(zhì)進(jìn)一步固縮聚集于核膜下，以及核固縮、核碎裂和凋亡小體等，以及在細(xì)胞周期G0／G1峰前出現(xiàn)一個(gè)特征性的凋亡峰，其平均凋亡率為（17．03±1．94）%，APR顯著增加，C6細(xì)胞生長受阻于G1／S期。

圖6 透射電鏡觀察（×10 000）Fig．6 Observation under the transmission electron microscope（×10 000）

既往研究業(yè)已證實(shí)改變低強(qiáng)度超聲的各種物理參數(shù)，如頻率、脈沖重復(fù)頻率、脈沖持續(xù)時(shí)間、聲輻射時(shí)間會(huì)直接影響受輻射細(xì)胞的結(jié)果，適當(dāng)?shù)穆暷芰織l件下，能獲得不同的腫瘤治療效果，過強(qiáng)的超聲聲能量則導(dǎo)致細(xì)胞壞死，而適當(dāng)?shù)穆暷芰靠梢鸺?xì)胞凋亡。同時(shí)微泡的加入通過其聲空化效應(yīng)不僅能增強(qiáng)超聲介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡率，更重要的是能降低超聲誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的閾值，減輕聲空化效應(yīng)的副損傷。本研究結(jié)果進(jìn)一步通過大鼠C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞驗(yàn)證了低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡能改變神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的命運(yùn)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；為膠質(zhì)瘤的治療提供了一種可能的策略。

超聲聯(lián)合微泡是通過超聲的聲空化效應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。聲空化效應(yīng)包括微泡的線性或非線性振動(dòng)的穩(wěn)態(tài)空化和瞬間空化，前者產(chǎn)生微波流（micro－streaming），后者產(chǎn)生沖擊波、輻射力、剪切力、自由基等復(fù)雜的物理效應(yīng)。沖擊波、輻射力等聲空化效應(yīng)能短暫改變細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其通透性，正像本研究掃描電鏡觀察到的細(xì)胞膜表面出現(xiàn)大小不同的小孔，部分小孔融合，該現(xiàn)象為超聲直接通過細(xì)胞膜提高穿透性提供了直接證據(jù)，與Ogawa等［8］觀察到的一樣，從形態(tài)學(xué)證實(shí)了低強(qiáng)度超聲能引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)損傷。而自由基和微波流導(dǎo)致的粘滯應(yīng)力，對(duì)細(xì)胞器、細(xì)胞骨架損傷、DNA單鏈斷裂，尤其是線粒體產(chǎn)生影響，通過對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)，引起細(xì)胞凋亡［8－11］，本研究通過組織學(xué)、免疫組化和透射電鏡觀察到細(xì)胞內(nèi)重要細(xì)胞器線粒體變化，其細(xì)胞皺褶、胞膜成泡、膜上磷脂酰絲氨酸反轉(zhuǎn)和DNA斷裂、染色體濃縮以及線粒體腫脹、嵴減少、甚至空泡化等線粒體結(jié)構(gòu)改變等典型的凋亡特征［12－14］。

有學(xué)者研究證實(shí)超聲聯(lián)合微泡介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡是通過線粒體細(xì)胞色素C等激活Caspase家族蛋白，包括Caspase－3、－6、－9等內(nèi)源性線粒體途徑實(shí)現(xiàn)的，最終破壞瘤細(xì)胞線粒體或核糖體［15］，或引起瘤細(xì)胞骨架成份（如微管、微絲）解體，從而引起腫瘤細(xì)胞增殖抑制和腫瘤細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)采用低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡誘導(dǎo)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的研究，進(jìn)一步證實(shí)了低強(qiáng)度超聲聯(lián)合微泡能引起C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖抑制和腫瘤細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能是通過聲空化效應(yīng)促使腫瘤細(xì)胞膜通透性增加，激活內(nèi)源性線粒體Caspase途徑，啟動(dòng)凋亡程序，最終達(dá)到細(xì)胞凋亡的目的。但上述發(fā)現(xiàn)僅僅是初步研究，超聲聯(lián)合微泡所形成聲空化效應(yīng)，包括聲孔效應(yīng)、啟動(dòng)凋亡、提高基因轉(zhuǎn)染等機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究［16－17］。

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