付佩彩， 喻志源， 李彩紅， 唐榮華， 葉茂斌， 王 偉

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430030

神經(jīng)血管單元（neurovascular unit，NVU）由神經(jīng)元－膠質(zhì)細(xì)胞－血管構(gòu)成，三者之間相互聯(lián)系，相互影響，共同參與腦缺血損傷后的再生修復(fù)［1］。其中腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（brain microvascular endothelial cell，BMEC）是血腦屏障的主要組成成分，它能夠限制可溶性物質(zhì)和細(xì)胞等從血液進(jìn)入大腦［2］。缺血性腦損傷后，微血管再生對(duì)神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能以及組織恢復(fù)起到重要作用［3］。鈉－鉀－氯共轉(zhuǎn)運(yùn)體1（Na＋－K＋－2Cl－cotransporter，NKCC1）是新近發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)離子通道，其在維持細(xì)胞的離子平衡、細(xì)胞體積以及細(xì)胞凋亡方面具有重要作用［4］。目前研究發(fā)現(xiàn)，NKCC1主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中［5］。腦缺血后，NKCC1表達(dá)增加，產(chǎn)生組織毒性，但其對(duì)微血管再生以及細(xì)胞增殖的影響尚不清楚。

本研究采用NKCC1特異性抑制劑布美他尼（Bumetanide）對(duì)原代培養(yǎng)的大鼠BMEC進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)細(xì)胞活力及細(xì)胞周期的變化，探討NKCC1通路對(duì)缺氧損傷后BMEC增殖的影響。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑

SD大鼠乳鼠來(lái)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。M199培養(yǎng)液、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胰蛋白酶、無(wú)糖培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；多聚賴(lài)氨酸、布美他尼和DAPI購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗VWF購(gòu)自美國(guó)BD公司；兔抗NKCC1購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；Edu試劑盒購(gòu)自上海銳博公司；FITC標(biāo)記羊抗小鼠和CY3標(biāo)記羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)Jackson公司。

1．2 大鼠BMEC原代培養(yǎng)及鑒定

12只出生1～3d的SD大鼠用75%乙醇浸泡消毒，取腦，放入預(yù)冷的D－Hanks液中清洗2次，小心剝離腦膜和血管，剪碎后用2mL研磨器研磨2、3次，過(guò)100目濾網(wǎng)，收集濾液。濾液過(guò)70μm一次性濾網(wǎng)，D－Hanks液多次沖洗，收集濾網(wǎng)上沉淀，沉淀多為微血管段，離心1 000r／min×10min，棄上清，加入0．1%的Ⅱ型膠原酶37℃振蕩消化30min。離心1 000r／min×10min，沉淀用含15%FBS的M199培養(yǎng)液重懸，接種于3個(gè)T25培養(yǎng)瓶中。24 h后換液，之后每隔2～3d換液，待細(xì)胞長(zhǎng)到85%以上重疊，消化傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。VWF染色鑒定微血管內(nèi)皮細(xì)胞。

1．3 實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞分別接種于96孔板、放置多聚賴(lài)氨酸預(yù)包被玻片的24孔板和6孔板中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞長(zhǎng)至70%左右融合后，分為對(duì)照組、氧糖剝奪／復(fù)氧（OGD／Reo）組及OGD／Reo＋Bumetanide組。其中對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)換用新鮮培養(yǎng)液，OGD／Reo組換用無(wú)糖培養(yǎng)液，OGD／Reo＋Bumetanide組換用含10μmol／L布美他尼的無(wú)糖培養(yǎng)液，后兩組在1%O2、5%CO2、37℃條件下（OGD干預(yù)）培養(yǎng)4h。OGD干預(yù)后，各組換用相應(yīng)的正常培養(yǎng)液，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)6、12、24h及48h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1．4 免疫熒光染色

24孔板細(xì)胞在復(fù)氧6、12、24h和48h時(shí)用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，PBS清洗2次，每次5min，用含0．2%Triton－X100的PBS破膜，BSA封閉后，加入相應(yīng)一抗（anti－VWF和anti－NKCC1）封閉過(guò)夜。PBS清洗，加入相應(yīng)二抗（CY3標(biāo)記羊抗兔IgG）室溫孵育1h。DAPI染細(xì)胞核，50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

1．5 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力

將細(xì)胞按1×105／mL密度同時(shí)接種于96孔板，每孔接種200μL，每組各設(shè)8個(gè)平行孔，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行，各時(shí)間點(diǎn)吸棄上清，加入50μL MTT繼續(xù)培養(yǎng)，4h后棄 MTT，加入100μL／孔DMSO，振蕩溶解紫色結(jié)晶10min，用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)定在570 nm波長(zhǎng)處吸光度值，以反映細(xì)胞活力。

1．6 Edu檢測(cè)細(xì)胞增殖

將細(xì)胞按5×105／mL密度同時(shí)接種于24孔板，每孔接種500μL，按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行，檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)前2h加入Edu溶液，在各時(shí)間點(diǎn)固定細(xì)胞。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。

1．7 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期

細(xì)胞按5×105／mL接種于6孔板中，每孔2 mL，于干預(yù)后不同時(shí)間點(diǎn)6、12、24、48h收取細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。細(xì)胞以0．25%胰酶消化，待細(xì)胞變圓后用全培養(yǎng)液終止，吹打脫壁，使其分散成單個(gè)細(xì)胞懸液；冷的PBS漂洗1次；加入預(yù)冷的80%乙醇固定細(xì)胞，－20℃冰箱保存；檢測(cè)前用PBS漂洗2次除去乙醇，加入1mL含200 μmol／L RNAase和50μmol／L PI的 PBS重懸細(xì)胞，4℃避光染色過(guò)夜，用Becton－Dickinson熒光激活細(xì)胞分選器進(jìn)行分析。

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 BMEC的特異性鑒定及NKCC1表達(dá)情況

原代培養(yǎng)的BMEC細(xì)胞體積較大，呈旋渦狀排列。將BMEC做VWF免疫熒光染色，證明原代培養(yǎng)的BMEC 98%表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗原VWF，且原代培養(yǎng)的BMEC 100%表達(dá)NKCC1（圖1）。

圖1 BMEC特異性鑒定及NKCC1表達(dá)Fig．1 Specificity identification of BMEC and expression of NKCC1

2．2 MTT檢測(cè)BMEC的活力

與對(duì)照組相比，OGD／Reo組在復(fù)氧6、12、24h和48h后細(xì)胞活力明顯降低（P＜0．05）；而布美他尼干預(yù)后，在復(fù)氧6、12、24h可促使細(xì)胞活力增加（P＜0．05）。見(jiàn)圖2。

圖2 MTT檢測(cè)不同干預(yù)組BMEC活力Fig．2 BMEC viability of different groups detected by MTT

2．3 Edu檢測(cè)BMEC增殖

OGD／Reo組干預(yù)后6、12、24h時(shí)Edu染色陽(yáng)性率較對(duì)照組顯著降低（P＜0．05）。OGD／Reo＋Bumetanide組布美他尼干預(yù)后，Edu陽(yáng)性率較OGD／Reo組明顯增加（P＜0．05）。48h時(shí)各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖3、4。

2．4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)BMEC的細(xì)胞周期變化

用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的變化：OGD／Reo組在6、12、24h和48h時(shí)，處于S期細(xì)胞明顯減少（P＜0．05），與 OGD／Reo組相比，在6、12h和24h時(shí)，OGD／Reo＋Bumetanide組S期細(xì)胞明顯增加（P＜0．05）（圖5、6）。

圖3 干預(yù)6h時(shí)各組細(xì)胞的Edu染色圖Fig．3 Edu dyeing images of different groups at 6h

圖4 各組Edu染色陽(yáng)性細(xì)胞率Fig．4 Edu positive rate of different groups

圖5 干預(yù)6h時(shí)各組細(xì)胞的流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果圖Fig．5 Flow cytometry results of different groups at 6h

3 討論

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（BMEC）為血腦屏障的主要組成部分，能夠限制可溶性物質(zhì)和細(xì)胞等從血液進(jìn)入大腦，并參與血管神經(jīng)單元組成［6－7］。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）受損后，腦組織水腫，BMEC腫脹破裂，血腦屏障破壞，有害物質(zhì)進(jìn)入腦組織，加劇組織損傷［8－9］。同時(shí)，BMEC可分泌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞遷移、分化。BMEC的增殖促進(jìn)了微血管再生，對(duì)神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞功能以及組織恢復(fù)起到重要作用［3］。

圖6 各組細(xì)胞中S期細(xì)胞百分比Fig．6 Percentage of cells in S phase in different groups

NKCC1是新近發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)離子通道，其在維持細(xì)胞的離子平衡、細(xì)胞體積、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞增殖方面具有非常大的作用［4］。目前研究發(fā)現(xiàn)，NKCC1主要表達(dá)在內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中［5］。生理?xiàng)l件下，NKCC1主要調(diào)節(jié)細(xì)胞中Na＋－K＋－2Cl－離子的平衡，從而維持適當(dāng)?shù)募?xì)胞體積［10］。NKCC1參與多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，研究證實(shí)，在大鼠線栓法大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）模型中，皮層神經(jīng)元中NKCC1的轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平都會(huì)顯著上調(diào)，抑制NKCC1的表達(dá)可以減輕腦梗死面積，減少神經(jīng)元凋亡［11］。NKCC1表達(dá)過(guò)多促進(jìn)早產(chǎn)兒癲癇發(fā)作，且抑制NKCC1可減輕脊髓損傷后疼痛［12－13］。腦缺血后 NKCC1對(duì) BMEC增殖的影響目前尚不清楚。

本研究顯示，OGD后，BMEC活力減低，增殖減弱。NKCC1的阻斷劑布美他尼干預(yù)可減輕OGD對(duì)BMEC增殖的影響，與OGD／Reo組相比，BMEC活力增加，增殖增強(qiáng)。提示NKCC1抑制劑對(duì)BMEC具有保護(hù)作用。既往研究顯示NKCC1通過(guò)與P38MAPK及ERK1／2信號(hào)通路相互作用，調(diào)節(jié)角膜上皮細(xì)胞增殖；通過(guò)影響細(xì)胞G0／G1周期調(diào)節(jié)人未分化細(xì)胞癌增殖［14－17］。因此我們推測(cè) NKCC1可能影響MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)OGD后BMEC增殖，其機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，NKCC1在BMEC增殖中發(fā)揮了重要作用，抑制NKCC1進(jìn)而促進(jìn)BMEC增殖可能為其促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的原因之一。本研究結(jié)果為進(jìn)一步了解CNS損傷后NKCC1作用、BMEC增殖機(jī)制及其調(diào)控方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ Gerritsen M E．Functional heterogeneity of vascular endothelial cells［J］．Biochem Pharmacol，1987，36（17）：2701－2711．

［2］ Engelhardt B，Sorokin L．The blood－brain and the blood－cerebrospinal fluid barriers：function and dysfunction［J］．Semin Immunopathol，2009，31（4）：497－511．

［3］ Lee S R，Wang X，Tsuji K，et al．Extracellular proteolytic pathophysiology in the neurovascular unit after stroke［J］．Neurol Res，2004，26（8）：854－861．

［4］ Jayakumar A R，Panickar K S，Curtis K M，et al．Na－K－Cl cotransporter－1in the mechanism of cell swelling in cultured astrocytes after fluid percussioninjury［J］．J Neurochem，2011，117（3）：437－448．

［5］ Sun D，Lytle C，O’Donnell M E．Astroglial cell－induced expression of Na－K－Cl cotransporter in brain microvascular endothelial cells［J］．Am J Physiol，1995，38（6）：1506－1512．

［6］ Hirooka T，Kaji T．The cytotoxicity of methylmercury in human microvascular endothelial cells and pericytes in culture［J］．Biol Pharm Bull，2012，35（8）：1201－1205．

［7］ Ronaldson P T，Davis T P．Blood－brain barrier integrity and glial support：mechanisms that can be targeted for novel therapeutic approaches in stroke［J］．Curr Pharm Des，2012，18（25）：3624－3644．

［8］ Pham L D，Hayakawa K．Crosstalk between oligodendrocytes and cerebral endothelium contributes to vascular remodeling after white matter injury［J］．Glia，2012，60（6）：875－881．

［9］ Hayakawa K，Seo J H．Cerebral endothelial derived vascular endothelial growth factor promotes the migration but not the proliferation of oligodendrocyte precursor cells in vitro［J］．Neurosci Lett，2012，513（1）：42－46．

［10］ Kahle K T，Staley K J，Nahed B V，et al．，Roles of the cationchloride cotransporters in neurological disease［J］．Nat Clin Pract Neurol，2008，4（9）：490－503．

［11］ Chen H，Luo J，Kintner D B，et al．Na＋－dependent chloride transporter（NKCC1）－null mice exhibit less gray and white matter damage after focal cerebral ischemia［J］．J Cereb Blood Flow Metab，2005，25（1）：54－66．

［12］ Garzon－Muvdi T，Schiapparelli P，ap Rhys C，et al．Regulation of brain tumor dispersal by NKCC1through a novel role in focal adhesion regulation［J］．PLoS Biology，2012，10（5）：e1001320．

［13］ Kahle K T，Simard J M，Staley K J，et al．Molecular mechanisms of ischemic cerebral edema：role of electroneutral ion transport［J］．Physiology（Bethesda），2009，24（4）：257－265．

［14］ Wang Z，Bildin V N，Yang H，et al．，Dependence of corneal epithelial cell proliferation on modulation of interactions between ERK1／2and NKCC1［J］．Cell Physiol Biochem，2011，28（4）：703－714．

［15］ Young S Z，Taylor M M，Wu S，et al．，NKCC1knockdown decreases neuron production through GABA（A）－regulated neural progenitor proliferation and delays dendrite development［J］．J Neurosci，2012，32（39）：13630－13638．

［16］ Shiozaki A，Miyazaki H，Niisato N，et al．Furosemide，a blocker of Na＋／K＋／2Cl－cotransporter，diminishes proliferation of poorly differentiated human gastric cancer cells by affecting G0／G1state［J］．J Physiol Sci，2006，56（6）：401－406．

［17］ 韓紅，黎緯明，鄒萍，等．JNK、P38－MAPK、IκB－α在異基因CD4＋T細(xì)胞致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的表達(dá)及與TF的關(guān)系［J］．華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，42（5）：515－519．