鄭 凱， 項(xiàng) 帥， 董漢華， 王 偉， 孫以民， 梅 斌△

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院1綜合科2肝臟外科，武漢 430030

肝硬化門(mén)靜脈高壓癥是我國(guó)常見(jiàn)病，其并發(fā)癥食管靜脈曲張破裂出血可危及生命。門(mén)靜脈系統(tǒng)新生血管研究對(duì)于探明門(mén)靜脈高壓癥的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制有著十分重要的意義。我們的前期研究表明，在門(mén)靜脈高壓癥大鼠食管靜脈曲張模型中可見(jiàn)CD133陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞，說(shuō)明內(nèi)皮祖細(xì)胞也可能參與了門(mén)脈高壓癥食管靜脈新血管的形成［1］。但其機(jī)制尚待進(jìn)一步探討。以往的研究表明，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）不僅可介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞參與新生血管形成，同時(shí)也是內(nèi)皮祖細(xì)胞的趨化因子之一［2－3］。本實(shí)驗(yàn)擬研究在門(mén)靜脈高壓癥食管靜脈曲張模型中，VEGF是否與內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)控相關(guān)。

1 材料與方法

1．1 模型建立及分組

SPF級(jí)雄性Sprague－Dawley大鼠30只購(gòu)自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，體重180～200g。采用門(mén)靜脈縮窄法制備食管靜脈曲張模型［1］，20只動(dòng)物隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組10只、治療組10只。另設(shè)假手術(shù)大鼠10只為對(duì)照組。3組大鼠均常規(guī)喂養(yǎng)；治療組于術(shù)后第3周開(kāi)始選擇性阻斷VEGF治療，經(jīng)尾靜脈注射選擇性VEGFR－2阻斷劑SU5416，劑量為5mg／kg，每日1次，連用1周［4］。

1．2 門(mén)靜脈血中VEGF濃度測(cè)定

實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組術(shù)后2周和術(shù)后4周分別剖殺大鼠各5只，留取門(mén)靜脈血標(biāo)本。按試劑盒手冊(cè)（谷歌公司，中國(guó)），ELISA法檢測(cè)門(mén)靜脈血中VEGF濃度。

1．3 組織病理學(xué)檢查

所有動(dòng)物4周后剖殺并測(cè)門(mén)靜脈壓力。留取肝臟、食管組織，石蠟包埋并切片，行蘇木精－伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肝硬化及食管靜脈曲張情況。另取一部分食管胃底組織，常溫下用4%多聚甲醛固定24h，石蠟包埋，5μm厚切片備用。

1．4 食管黏膜下血管內(nèi)皮細(xì)胞CD133表達(dá)測(cè)定

采用DAKO公司EnVision二步法免疫組化試劑盒檢測(cè)食管石蠟切片中CD133的表達(dá)情況。食管縱軸切片常規(guī)脫蠟入水，PBS洗2次，3%過(guò)氧化氫甲醇溶液室溫避光封閉10min，PBS洗2次。切片浸泡在pH6的枸櫞酸鹽緩沖液中，用微波爐92℃～98℃熱修復(fù)抗原20min，自然冷卻至室溫，PBS洗2次。CD133一抗1∶200稀釋，4℃孵育過(guò)夜，PBS洗3次。EnVision二抗工作液，室溫孵育30min，PBS洗3次；DAB染色，光鏡下控制反應(yīng)時(shí)間。蘇木精復(fù)染，透明，中性樹(shù)膠封片。

1．5 形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)量分析

上述切片用 Nikon Digital ECLIPSE C1系統(tǒng)（Nikon Corporation，Japan）采集圖片。采用Image－Pro Plus 6．0軟件系統(tǒng)分析圖片。計(jì)數(shù)每個(gè)低倍視野下食管黏膜下層靜脈數(shù)量、面積及CD133陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量、面積。計(jì)算CD133陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)／食管黏膜下層靜脈數(shù)百分比和CD133陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞面積／食管黏膜下層靜脈面積百分比，以減小因靜脈管腔大小差異帶來(lái)的誤差。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2．1 大鼠食管靜脈曲張形成

實(shí)驗(yàn)組、治療組大鼠食管靜脈曲張明顯。HE切片光鏡下可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟硬化，形成明顯假小葉，纖維條索粗大。食管縱軸切面下可見(jiàn)食管黏膜下層靜脈曲張明顯。對(duì)照組大鼠肝臟未見(jiàn)硬化，食管黏膜下層靜脈未見(jiàn)曲張。

2．2 門(mén)靜脈血中VEGF水平

實(shí)驗(yàn)組術(shù)后第2周門(mén)靜脈血中VEGF水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（2．04±1．12ng／mL vs．（1．63±0．92）ng／mL］，術(shù)后第4周門(mén)靜脈血中VEGF水平較對(duì)照組明顯上調(diào)［（6．37±2．91）ng／mL vs．（1．75±0．71）ng／mL，P＜0．05］。

2．3 食管黏膜下血管內(nèi)皮細(xì)胞CD133的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組、治療組大鼠食管黏膜下血管可見(jiàn)CD133陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)照組大鼠食管黏膜下血管未見(jiàn)CD133陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞（圖1）。治療組術(shù)后CD133陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)／食管黏膜下層靜脈數(shù)百分比和CD133陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞面積／食管黏膜下層靜脈面積百分比均較實(shí)驗(yàn)組明顯下降（均P＜0．05），見(jiàn)表1。

圖1 門(mén)靜脈高壓癥食管靜脈曲張大鼠食管黏膜下血管CD133的表達(dá)（DAB染色，×400）Fig．1 CD133expression in esophageal submucosal vessels of the rat with portal hypertension and esophageal varices（DAB staining，×400）

表1 選擇性阻斷VEGF治療后大鼠食管黏膜下血管CD133陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞比例的變化（±s，n＝10，%）Table 1 Changes of CD133positive rate of rat esophageal submucosal vascular endothelial cells after treatment of selectively blocking the VEGF－induced signaling（±s，n＝10，%）

表1 選擇性阻斷VEGF治療后大鼠食管黏膜下血管CD133陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞比例的變化（±s，n＝10，%）Table 1 Changes of CD133positive rate of rat esophageal submucosal vascular endothelial cells after treatment of selectively blocking the VEGF－induced signaling（±s，n＝10，%）

與實(shí)驗(yàn)組比較，＊P＜0．05

食管黏膜下層靜脈面積實(shí)驗(yàn)組組別 CD133陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)／食管黏膜下層靜脈數(shù)CD133陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞面積／54．2±11．4 23．7±6．7治療組 31．7±9．0＊ 11．3±5．9＊

3 討論

門(mén)靜脈系統(tǒng)新生血管研究對(duì)于探明門(mén)靜脈高壓癥的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制有著十分重要的意義?？刂聘斡不T(mén)靜脈高壓癥發(fā)病過(guò)程中過(guò)度的血管生成，可能有助于緩解甚至消除食管胃底靜脈曲張。我們的前期研究表明，門(mén)靜脈高壓癥食管靜脈曲張模型大鼠門(mén)靜脈血中內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量增加，且與食管黏膜下靜脈密度呈正相關(guān)［1］。與此同時(shí)，在門(mén)靜脈高壓癥食管靜脈曲張模型大鼠及人體食管黏膜下血管中均可見(jiàn)CD133陽(yáng)性的內(nèi)皮細(xì)胞，而對(duì)照組無(wú)陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)。CD133是內(nèi)皮祖細(xì)胞的表面標(biāo)志物，而分化成熟的內(nèi)皮細(xì)胞則不表達(dá)CD133，因此CD133可作為區(qū)分內(nèi)皮祖細(xì)胞與成熟內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物［5］。這些結(jié)果可初步證明：在大鼠門(mén)脈高壓癥食管靜脈曲張模型中，有骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞被激活并釋放入外周血，可能參與食管靜脈新血管的形成。

然而，內(nèi)皮祖細(xì)胞受哪些局部因子趨化而來(lái)，如何發(fā)揮作用，尚待進(jìn)一步探討。以往的研究表明，VEGF是內(nèi)皮祖細(xì)胞的趨化因子之一［6－7］，因此，我們推測(cè)在門(mén)靜脈高壓癥食管靜脈曲張模型中，VEGF可能與內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)控相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，在大鼠門(mén)靜脈高壓癥食管靜脈曲張模型中，門(mén)靜脈血中VEGF水平在2周時(shí)與對(duì)照組無(wú)顯著差異，而在4周時(shí)明顯上調(diào)。由于VEGF是內(nèi)皮祖細(xì)胞的趨化因子之一，說(shuō)明其可能促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞參與部分食管曲張靜脈的形成，在靜脈曲張形成過(guò)程中逐步升高。

由于VEGF作用的下游因子眾多，門(mén)靜脈血中VEGF水平上調(diào)亦可能是作用于其它因子，如內(nèi)皮細(xì)胞，參與新生血管形成［7－11］。因此，為了證明本模型中VEGF與內(nèi)皮祖細(xì)胞的關(guān)系，我們選用選擇性VEGFR－2阻斷劑SU5416，將其用于門(mén)脈高壓癥食管靜脈曲張模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，選擇性阻斷VEGF的作用后，大鼠食管黏膜下血管CD133陽(yáng)性內(nèi)皮細(xì)胞比例顯著下降。這間接證明了VEGF參與食管靜脈曲張新生血管形成的部分機(jī)制是通過(guò)內(nèi)皮祖細(xì)胞發(fā)揮作用的。

綜合本研究及我們的前期研究，我們初步認(rèn)為內(nèi)皮祖細(xì)胞可能參與了門(mén)脈高壓癥食管靜脈新血管的形成，部分機(jī)制是受VEGF的趨化與調(diào)控。這是食管靜脈曲張形成機(jī)制的一個(gè)新線索。如果進(jìn)一步探明其調(diào)控機(jī)制，則其可能成為抗血管新生治療的新靶點(diǎn)。

然而，本研究?jī)H采用了門(mén)靜脈高壓癥食管靜脈曲張形成的一種原理——門(mén)靜脈縮窄（肝前型門(mén)脈高壓癥）而制作的大鼠模型得出上述結(jié)論。而針對(duì)門(mén)靜脈高壓癥食管靜脈曲張形成的另一種原理——肝內(nèi)阻塞（肝內(nèi)型門(mén)脈高壓癥），尚有待制作相關(guān)模型［12］后進(jìn)行進(jìn)一步研究。此外，內(nèi)皮祖細(xì)胞參與門(mén)靜脈高壓癥食管靜脈曲張形成的進(jìn)一步機(jī)制及其他調(diào)控因子，亦需要進(jìn)一步探討。

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