陳蓮一， 謝 林

1湖北省醫(yī)學(xué)會(huì)，武漢 430071

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院器官移植研究所，器官移植教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，衛(wèi)生部器官移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430030

現(xiàn)階段，對(duì)血睪屏障的認(rèn)識(shí)早已不僅僅局限于上皮細(xì)胞的緊密連接（解剖學(xué)屏障），Sertoli細(xì)胞等睪丸間質(zhì)細(xì)胞形成的免疫屏障越來(lái)越受到研究者的重視，血睪屏障能夠阻擋精子的抗原性，防止機(jī)體對(duì)精子產(chǎn)生抗體而發(fā)生自身免疫反應(yīng)［1］，因此睪丸也被認(rèn)為是免疫特惠器官之一?；赟ertoli細(xì)胞表達(dá)及分泌的細(xì)胞因子在睪丸免疫特惠微環(huán)境中發(fā)揮著重要的免疫調(diào)節(jié)和免疫抑制作用，本課題旨在研究Sertoli細(xì)胞對(duì)同種異體免疫反應(yīng)過(guò)程中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）／輔助性T細(xì)胞17（Th17）平衡的影響。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取雄性Balb／c小鼠，鼠齡為2周，用于獲取睪丸Sertoli細(xì)胞和骨髓來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）。另選取雄性C57BL／6小鼠，鼠齡為4周，用于獲取效應(yīng)性T淋巴細(xì)胞。所有實(shí)驗(yàn)用小鼠均購(gòu)自北京華阜康公司。

1．2 Sertoli細(xì)胞分離與培養(yǎng)

無(wú)菌條件下切取Balb／c小鼠睪丸，用含1 mmol／L乙二胺四乙酸（EDTA）和0．5%牛血清白蛋白（BSA）的 Hank’s平衡液（HBSS）清洗，剪碎至1mm×1mm×1mm小塊；采用膠原酶Ⅴ（2．5mg／mL，Sigma公司）在37℃消化10min，其后用HBSS洗消化物3遍；再采用胰酶（25μg／mL，Sigma公司）及DNase（4μg／mL，Sigma公司）混合液在37℃消化10min，用HBSS洗4遍；最后將獲得的細(xì)胞沉淀懸浮于高糖DMEM－F12培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，Gibco公司）中，用500μm濾網(wǎng)過(guò)濾，接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。

1．3 光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡下觀察Sertoli細(xì)胞

將多聚賴氨酸處理過(guò)的玻片置于6孔板底，消化下的濃縮Sertoli細(xì)胞懸液吹打混勻后滴在玻片上，2h后再追加完全培養(yǎng)液。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜后，取出長(zhǎng)有單層Sertoli細(xì)胞的玻片，37℃下以4%多聚甲醛固定10min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3遍，蘇木精溶液染色15min，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)，伊紅溶液染色30s，自來(lái)水沖洗后用中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察。用胰酶將細(xì)胞消化下來(lái)后，將細(xì)胞懸液800r／min離心10min濃縮，然后將濃縮細(xì)胞懸液置于1．5mL Ependorf管中，1 500r／min離心10min，獲得管底細(xì)胞沉淀；沿管壁緩慢加入2．5%戊二醛固定，用PBS洗3遍；然后加入1%鋨酸后固定1h，PBS沖洗3遍；至室溫下用梯度濃度丙酮脫水；包埋劑滲透、包埋后，制作超薄切片。切片用檸檬酸鉛染色10min，去二氧化碳雙蒸水洗3遍，再用醋酸鈾染色30min，雙蒸水洗3遍，干燥后，于透射電鏡下觀察。

1．4 T淋巴細(xì)胞分離

無(wú)菌條件下切取C57BL／6小鼠脾臟，用HBSS液清洗，去除結(jié)締組織和脂肪組織，將脾臟置于100目細(xì)胞篩中，輕壓脾臟使脾細(xì)胞分散，篩濾后落入裝有RPMI－1640培養(yǎng)液的離心管中，用PBS洗2遍，離心后獲得脾細(xì)胞懸液。采用CD4＋T細(xì)胞分離試劑盒（美天旎公司），磁珠分選獲得CD4＋T細(xì)胞，純度＞95%。從獲得的CD4＋T細(xì)胞中，采用磁珠分選法（美天旎公司）分選獲得 Na?ve CD4＋T 細(xì)胞（CD4＋CD62L＋CD25－）。

1．5 骨髓來(lái)源的DC細(xì)胞分離與培養(yǎng)

無(wú)菌條件下分離C57BL／6小鼠腿骨，剪斷獲取股骨和脛骨，浸泡于4℃RPMI－1640培養(yǎng)液中，去除肌肉組織，用注射器吸取RPMI－1640培養(yǎng)液將骨髓沖出，離心后用含有粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM－CSF，150ng／mL）和IL－4（800U／mL）的RPMI－1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，3d后，半量更換培養(yǎng)液，第7天收獲DC細(xì)胞。

1．6 混合細(xì)胞培養(yǎng)

1．6．1 Sertoli細(xì)胞與同種異體T細(xì)胞混合培養(yǎng) 將Sertoli細(xì)胞（4×103個(gè)／孔）接種于96孔培養(yǎng)板中，高糖DMEM－F12培養(yǎng)過(guò)夜，再加入新分選出的Na?ve CD4＋T細(xì)胞（2×104個(gè)／孔）共同培養(yǎng)（培養(yǎng)液中含1．5μg／mL ConA，Sigma公司）。收集培養(yǎng)上清。

1．6．2 DC細(xì)胞與同種異體T細(xì)胞混合培養(yǎng) 將DC細(xì)胞（4×103個(gè)／孔）接種于96孔培養(yǎng)板中，RPMI－1640培養(yǎng)過(guò)夜，再與新分選出的 Na?ve CD4＋T細(xì)胞（2×104個(gè)／孔）混合［2］，分別采用高糖 DMEMF12培養(yǎng)液或Sertoli細(xì)胞／T細(xì)胞混合培養(yǎng)4d的上清液，共同培養(yǎng)DC細(xì)胞／T細(xì)胞4d。

1．7 Western blot檢測(cè)

移去Sertoli細(xì)胞培養(yǎng)液，用RIPA緩沖液（Santa Cruz公司）裂解培養(yǎng)板底部貼壁的Sertoli細(xì)胞，提取總蛋白。蛋白濃度用二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定。20μg蛋白加樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS－PAGE），轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉－TBST緩沖液封閉。再用抗小鼠人類主要組織相容性復(fù)合體（MHC）－Ⅱ、抗小鼠B7－H1、抗小鼠β－肌動(dòng)蛋白（β－actin）等抗體（Santa Cruz公司），4℃孵育過(guò)夜，洗3遍后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1h，洗3遍后以增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）法檢測(cè)蛋白表達(dá)相對(duì)量。

1．8 分泌細(xì)胞因子檢測(cè)

Sertoli細(xì)胞培養(yǎng)上清內(nèi)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）－β1、白細(xì)胞介素（IL）－17A 等細(xì)胞因子采用eBioscience公司的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒檢測(cè)，檢測(cè)方法參照說(shuō)明書(shū)。

1．9 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

收集懸浮的T細(xì)胞，用含1%BSA的冷PBS液洗3遍后，采用熒光標(biāo)記的抗CD25、Foxp3、IL－17A等抗體（BD公司）4℃孵育30min，洗2遍后行流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)。數(shù)據(jù)應(yīng)用FlowJo軟件分析。

1．10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 12．0統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 小鼠Sertoli細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

Sertoli細(xì)胞在爬片中形成單層貼壁分布，光學(xué)顯微鏡下蘇木精－伊紅（HE）染色可見(jiàn)，胞體呈不規(guī)則的長(zhǎng)多邊形，胞體上多有3個(gè)或3個(gè)以上的突起，細(xì)胞核不規(guī)則，較大，雙核細(xì)胞較常見(jiàn)，核染色質(zhì)染色淺，核內(nèi)清晰可見(jiàn)深染的核仁，高倍鏡下可見(jiàn)胞質(zhì)中含有多個(gè)脂質(zhì)小體空泡（圖1）。透射電鏡下觀察Sertoli細(xì)胞，可見(jiàn)其胞質(zhì)中含有大量線粒體、高爾基復(fù)合體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和脂質(zhì)小體，細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核大而淡染，核膜有多個(gè)皺褶或小凹，核仁大而明顯，其兩側(cè)各有1個(gè)衛(wèi)星核小體，與核仁共同組成直線或三角形排列的核仁三聯(lián)復(fù)合體，此為Sertoli細(xì)胞的典型結(jié)構(gòu)（圖2）。

2．2 Sertoli細(xì)胞中B7－H1、MHC－Ⅱ的表達(dá)

Western blot結(jié) 果 顯 示，與同種 異 體 Na?ve CD4＋T細(xì)胞共培養(yǎng)后，Sertoli細(xì)胞高表達(dá)B7－H1分子和MHC－Ⅱ類分子（圖3）。

2．3 Sertoli與同種異體Na?ve CD4＋T細(xì)胞體外混合培養(yǎng)促進(jìn)TGF－β1 的分泌

小鼠Sertoli細(xì)胞體外培養(yǎng)72h，培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子濃度用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)，結(jié)果顯示單獨(dú)Sertoli細(xì)胞體外培養(yǎng)即能夠分泌TGF－β1，濃度隨培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)而增加，TGF－β1濃度從2 h的（77．31±21．99）pg／mL逐漸增加至72h的（174．89±23．51）pg／mL。與同種異體Na?ve CD4＋T細(xì)胞混合培養(yǎng)，上清液中的TGF－β1濃度顯著提高，72h達(dá)到（823．10±59．07）pg／mL，較單純Sertoli培養(yǎng)組顯著升高（P＜0．01，圖4）。

圖1 小鼠Sertoli細(xì)胞蘇木精－伊紅染色（×200）Fig．1 Hematoxylin eosin staining of mouse Sertoli cells（×200）

圖2 小鼠Sertoli細(xì)胞透射電鏡成像Fig．2 Image of mouse Sertoli cells under transmission electron microscope

圖3 Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞中B7－H1、MHC－Ⅱ分子的表達(dá)Fig．3 Expression of B7－H1，MHC－Ⅱcells in each cells by Western blot

圖4 ELISA法檢測(cè)Sertoli細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TGF－β1濃度Fig．4 Concentration of TGF－β1in Sertoli cell culture supernatant determined by ELISA

2．4 Sertoli細(xì)胞體外誘導(dǎo)Na?ve CD4＋ T細(xì)胞分化為CD25＋Foxp3＋Treg細(xì)胞

CD25和Foxp3是目前公認(rèn)的特異性Treg標(biāo)記，前者表達(dá)于細(xì)胞表面，后者位于細(xì)胞內(nèi)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與同種異體Sertoli細(xì)胞共同培養(yǎng)的體系內(nèi)，Na?ve CD4＋T 細(xì)胞（CD4＋CD62L＋CD25－）被誘導(dǎo)分化為CD25＋Foxp3＋Treg細(xì)胞的比例顯著增加，從＜1%增長(zhǎng)至27．6%（圖5）。

圖5 Sertoli細(xì)胞體外誘導(dǎo)Na?ve CD4＋T細(xì)胞分化為CD25＋Foxp3＋Treg細(xì)胞Fig．5 Sertoli cells induced Na?ve CD4＋ T cells to differentiate into CD25＋Foxp3＋Treg cells in vitro detected by FACS

2．5 Sertoli／Treg細(xì)胞混合培養(yǎng)上清液抑制DC細(xì)胞誘導(dǎo)Na?ve CD4＋ T細(xì)胞分化為T(mén)h17

本研究中，已證實(shí)Sertoli細(xì)胞可誘導(dǎo)同種異體Na?ve CD4＋T細(xì)胞分化為CD25＋Foxp3＋Treg細(xì)胞，混 合 培 養(yǎng) 的 上 清 液 中 （Sertoli／Treg supernatant，STS）含有高濃度的 TGF－β1，用此上清液孵育DC細(xì)胞／Na?ve CD4＋T細(xì)胞，可明顯減少培養(yǎng)液中IL－17A的濃度，使其從（361．58±80．27）pg／mL降低至（137．54±52．19）pg／mL（P＜0．05，圖6）；同時(shí)IL－17A＋T細(xì)胞亞群百分比也顯著降低（27．2%降至17．9%，圖7）。

圖6 ELISA法檢測(cè)DC細(xì)胞／Na?ve CD4＋T細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL－17A水平Fig．6 Concentration of IL－17Ain Sertoli cells culture supernatant detected by ELISA

圖7 STS抑制DC細(xì)胞誘導(dǎo)Na?ve CD4＋T細(xì)胞分化為IL－17A＋T細(xì)胞Fig．7 STS inhibited the differentiation of na?ve CD4＋T cells into IL－17A＋ T cells induced by DC

3 討論

血睪屏障（BTB）是睪丸中血管和曲精細(xì)管之間的屏障。這一屏障是由曲精細(xì)管的支持細(xì)胞——Sertoli細(xì)胞之間的緊密連接形成［3］。它為精原細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)，并防止細(xì)胞毒性物質(zhì)進(jìn)入曲精細(xì)管干擾精子發(fā)生和損害已形成的精子。有研究證實(shí)，Sertoli細(xì)胞形成的睪丸免疫特惠區(qū)，能夠?yàn)橥N異體或異種的組織（如皮膚皮片、胰腺或甲狀旁腺等）提供免疫保護(hù)作用，使移植到睪丸間質(zhì)的外源組織的存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)［4］。將同種異體或異種胰島移植入睪丸間質(zhì)內(nèi)，與腎臟和肝臟等移植部位相比，胰島移植物的存活率顯著增加，而且在小鼠及恒河猴糖尿病動(dòng)物模型中，受體的血糖水平均得到了顯著改善［4－5］。目前認(rèn)為，血睪屏障的主要形成細(xì)胞——Sertoli細(xì)胞形成的微環(huán)境能夠?yàn)樽陨砩臣?xì)胞提供免疫保護(hù)作用，它能夠阻止抗體和免疫細(xì)胞通過(guò)血睪屏障進(jìn)入睪丸內(nèi)。Sertoli細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎細(xì)胞因子和免疫抑制細(xì)胞因子能夠調(diào)控免疫反應(yīng)［6－7］。將Sertoli細(xì)胞移植到機(jī)體的其他部位，能夠有效存活并保護(hù)共移植的異體和異種細(xì)胞［8］，這說(shuō)明Sertoli細(xì)胞能夠在異位創(chuàng)造免疫特惠的微環(huán)境，這種保護(hù)作用不是來(lái)自于解剖學(xué)上的細(xì)胞間緊密連接，而是通過(guò)Sertoli細(xì)胞在局部表達(dá)或分泌免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［9－10］。

輔助性T細(xì)胞17（Th17）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的不同于輔助性T細(xì)胞1（Th1）和輔助性T細(xì)胞2（Th2）的兩類CD4＋T細(xì)胞亞群［11］。Th17可介導(dǎo)慢性炎性反應(yīng)，腎［12］、肺［13］、肝［14］等多種實(shí)體器官移植患者體內(nèi)均可檢測(cè)到高水平的白細(xì)胞介素（IL）－17，其作為T(mén)h17細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，在急、慢性排斥反應(yīng)中扮演了重要的角色［15］。而CD4＋Foxp3＋Treg被認(rèn)為是參與移植免疫耐受的最主要的T細(xì)胞亞型，它不但能夠抑制Th1、Th2細(xì)胞的免疫功能［16］，對(duì)Th17介導(dǎo)的炎性反應(yīng)和排斥反應(yīng)也具有調(diào)節(jié)作用［17］。移植物排斥或耐受的發(fā)生和進(jìn)展是體內(nèi)Th17／Treg平衡相互作用和制約的結(jié)果，幼稚T細(xì)胞在不同的細(xì)胞因子微環(huán)境內(nèi)能夠分別分化為T(mén)h17或Treg亞群，前者引發(fā)效應(yīng)性T細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)移植物排斥，后者則誘導(dǎo)移植物耐受［18］。已有報(bào)道，供者特異性Treg可通過(guò)B7－H1途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生［19］，因此我們研究了Sertoli細(xì)胞是否能夠在體外誘導(dǎo)CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg的產(chǎn)生。

TGF－β1是誘導(dǎo)供者特異性CD4＋T細(xì)胞分化為Foxp3＋Treg的關(guān)鍵細(xì)胞因子［20］，在 TGF－β1環(huán)境中，T細(xì)胞表達(dá)Treg的轉(zhuǎn)錄因子叉狀頭／翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（Foxp3），后者結(jié)合到Th17相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子孤兒核受體（RORC／RORA）上，抑制細(xì)胞向Th17亞型分化［21］。Sertoli細(xì)胞在炎癥環(huán)境下高表達(dá) TGF－β、IL－6等基因［22］。其產(chǎn)生的FasL、吲哚胺2，3－雙加氧酶（IDO）以及 TGF－β對(duì)延長(zhǎng)移植物存活時(shí)間具有重要作用［23］。DC細(xì)胞能夠在體外誘導(dǎo)CD4＋CD25－Na?ve T細(xì)胞分化為 Th17樣細(xì)胞（可分泌IL－17A）［24］。TGF－β1是 維 持 T 細(xì) 胞 Treg／Th17分化平衡的關(guān)鍵細(xì)胞因子，在以TGF－β1為主導(dǎo)的細(xì)胞因子環(huán)境中，由APC細(xì)胞激活的CD4＋T細(xì)胞向Foxp＋Treg表型分化，而IL－6、IL－21等細(xì)胞因子則促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，誘導(dǎo)炎癥及排斥反應(yīng)發(fā)生［25－26］。

我們?cè)诒狙芯恐杏^察了Sertoli細(xì)胞對(duì)同種異體免疫反應(yīng)過(guò)程中Th17／Treg平衡的影響。成功在體外培養(yǎng)并分化了Sertoli細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞及骨髓來(lái)源的DC細(xì)胞，并分別將Sertoli、DC細(xì)胞與同種異體T細(xì)胞混合培養(yǎng)，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，Sertoli細(xì)胞與 同 種 異 體 Na?ve CD4＋T 細(xì) 胞（CD4＋CD62L＋CD25－）在體外混合培養(yǎng)時(shí)，其表面的MHC－Ⅱ類分子和B7－H1分子的表達(dá)量增加；ELISA結(jié)果顯示，Sertoli細(xì)胞體外培養(yǎng)會(huì)分泌TGF－β1，且濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。與同種異體Na?ve CD4＋T細(xì)胞混合培養(yǎng)72h后，培養(yǎng)上清液中的TGF－β1濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與同種異體Sertoli細(xì)胞共同培養(yǎng)的體系內(nèi)，Na?ve CD4＋T細(xì)胞（CD4＋CD62L＋CD25－）被誘導(dǎo)分化為 CD25＋Foxp3＋Treg細(xì)胞的比例顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明Sertoli細(xì)胞體外誘導(dǎo)Na?ve CD4＋T細(xì)胞分化為CD25＋Foxp3＋Treg細(xì)胞。Sertoli細(xì)胞可誘導(dǎo)同種 異 體 Na?ve CD4＋T 細(xì) 胞 分 化 為 CD25＋Foxp3＋Treg細(xì)胞，混合培養(yǎng)的上清液中含有高濃度的TGF－β1，本研究用此上清液孵育DC細(xì)胞／Na?ve CD4＋T細(xì)胞，可明顯減少培養(yǎng)液中IL－17A的濃度，同時(shí)IL－17A＋T細(xì)胞亞群百分比也顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，我們推測(cè)Sertoli細(xì)胞與Treg細(xì)胞混合培養(yǎng)的上清液可抑制DC細(xì)胞誘導(dǎo)Na?ve CD4＋T細(xì)胞分化為T(mén)h17。

本研究結(jié)果表明，Sertoli細(xì)胞體外培養(yǎng)產(chǎn)生的抗炎細(xì)胞因子和免疫抑制細(xì)胞因子能夠調(diào)控免疫反應(yīng)，并 誘 導(dǎo) Na?ve CD4＋T 細(xì) 胞 分 化 為 CD25＋Foxp3＋Treg細(xì)胞，Sertoli細(xì)胞可能通過(guò)調(diào)節(jié)同種異體Treg／Th17分化平衡，誘導(dǎo)免疫耐受，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

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