薛秀蘭， 林菊生

1廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科，廈門 361000

2華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院肝病研究所，武漢 430030

肝硬化是各種慢性肝病發(fā)展的最終階段，是肝臟對各種慢性損傷的一種應(yīng)答反應(yīng)。盡管有許多關(guān)于肝硬化的研究，但肝硬化的機(jī)制尚未完全闡明。目前認(rèn)為活化的肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）是肝纖維化的主要來源細(xì)胞。HSC的激活最終可造成細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在肝內(nèi)過量沉積，導(dǎo)致肝纖維化［1］。各種生長因子和細(xì)胞因子可刺激HSC活化［2］；活化的HSC鈣離子通道大量開放，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（intracellular Ca2＋concentration，［Ca2＋］i）增加，導(dǎo)致細(xì)胞收縮明顯，鈣離子在介導(dǎo)HSC舒縮中發(fā)揮重要作用［3］。此外，一系列證據(jù)還顯示脂質(zhì)蓄積與纖維化有一定的聯(lián)系。流行病學(xué)研究證明肥胖和脂肪肝是酒精性肝病和慢性丙型肝炎發(fā)展成肝硬化的危險(xiǎn)因子［4］。然而，目前還沒有直接證據(jù)表明肝內(nèi)脂肪累積與肝硬化有因果關(guān)聯(lián)。

瘦素（leptin）是由ob基因編碼的分泌型蛋白質(zhì)，主要由貯脂細(xì)胞產(chǎn)生的。研究表明活化的HSC中l(wèi)eptin mRNA和蛋白質(zhì)合成增加。有研究報(bào)道leptin在大鼠肝纖維化中起一定作用［5－6］，然而leptin在肝硬化發(fā)展過程中的作用仍未明確。由于小干擾 RNA（small interfering RNA，siRNA）能夠長期發(fā)揮阻斷基因的作用［7］，因此本研究構(gòu)建leptinsiRNA轉(zhuǎn)染HSC，觀察其對HSC生物活性的影響和細(xì)胞內(nèi)［Ca2＋］i變化，以期為以leptin為靶點(diǎn)的肝纖維化基因治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)試劑和主要儀器

瘦素兔抗鼠多克隆IgG抗體為Santa Cruz公司產(chǎn)品；RPMI－1640培養(yǎng)液為Gibco公司產(chǎn)品；MTT為美國Sigma公司產(chǎn)品。免疫組化SP試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司。β－actin一抗、二抗為博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。leptin－siRNA和siRNA對照組均為上海生工生物技術(shù)研究所合成，基因序列為：leptin－siRNA，上游引物5′－TCCCAACCCTCATCAAGACCATTGCCACCCAATGGTCTTGATGAGGGTTT－3′，下游引物 5′－CAAAAAACCCTCATCAAGACCATTGGGTGGCAATGGTCTTGATGAGGGTT－3′；siRNA 對照組，上游引物 5′－TCCCAGCATGCCGTACAGACATCTACCACCTTAGATGTCTGTACGGCATGCTT－3′， 下游 引 物 5′－CAAAAAGCATGCCGTACGACAATCTAAGGTGGTTAGATGTCTGTACGGCATGCT－3′。Annexin－FITCPI為南京凱基生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。脂質(zhì)體Lipofectamine2000為Invitrogen公司產(chǎn)品。碘化丙啶（PI）購自Sigma公司。主要儀器：FCM流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；Ca2＋成像系統(tǒng)（Olympus FV－300）；倒置顯微鏡（O－lympus IX－70型）；激光聚焦顯微鏡（Olympus FV－300）。

1．2 細(xì)胞培養(yǎng)和基因轉(zhuǎn)染

細(xì)胞分為4組：正常對照組、空載體對照組、siRNA對照組和leptin－siRNA組。HSC由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院肝病研究所提供。細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含10%FBS的RPMI－1640培養(yǎng)液，37℃恒溫密閉式5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將細(xì)胞經(jīng)0．25%胰酶消化后按每孔4×104個(gè)細(xì)胞接種至6孔培養(yǎng)板上，待細(xì)胞長至80%融合后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染，每孔 Lipofectamine 4 μL，siRNA質(zhì)粒2μL。轉(zhuǎn)染后在300μg／mL G418培養(yǎng)液中進(jìn)行篩選，篩選3周后換新鮮不含抗生素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1．3 免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測leptin蛋白表達(dá)

收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，取1×105細(xì)胞PBS洗3次后，用涂片機(jī)將細(xì)胞甩于已涂多聚賴氨酸的載玻片上。用1∶1丙酮和無水乙醇固定。加1∶10馬血清封閉，37℃濕盒內(nèi)放置30min。棄去血清，加一抗和二抗，加過氧化物酶標(biāo)記的親和素。浸入新鮮底物溶液（DAB 50mg＋100mL THB），顯色并照相。

1．4 Western blot測定leptin蛋白含量

每組收集1×107細(xì)胞，冷PBS洗滌細(xì)胞2次，常溫晾干，加入50μL裂解液裂解細(xì)胞，樣品冰浴45min，Bradford法檢測蛋白質(zhì)含量，取上述蛋白50μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳及轉(zhuǎn)移電泳，隨后與特異性抗體進(jìn)行Western blot分析。一抗為羊抗鼠leptin多克隆蛋白抗體（1∶100），二抗用辣根過氧化酶標(biāo)記的IgG抗體（1∶1 000），雜交膜用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒（ECL）法于暗室顯影并照相。

1．5 細(xì)胞周期檢測

采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量。以0．25%胰酶和0．02%EDTA處理各組細(xì)胞，用冷PBS洗滌，然后懸浮在冰冷的反應(yīng)緩沖液中，使細(xì)胞密度為1×106／mL；取100μL細(xì)胞懸液加入5 μL PI室溫避光染色30min，再加入反應(yīng)緩沖液400 μL終止反應(yīng)，流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1．6 細(xì)胞活性檢測

以MTT法檢測細(xì)胞活性。分別在96孔板上按4 000～6 000個(gè)／孔接種各組細(xì)胞，于細(xì)胞處理24、48、72h后，每孔加入20μL 0．5%MTT 溶液37℃作用4h；再加入150μL／孔DMSO，置搖床上搖10min，用自動(dòng)酶標(biāo)儀于490nm波長下測定吸光度（A）值。計(jì)算細(xì)胞抑制率＝（1－實(shí)驗(yàn)組A值／正常對照組A值）×100%。

1．7 Fura－2／AM 檢測［Ca2＋ ］i

將第2代或第3代細(xì)胞接種于6孔板中，按照分組要求處理細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，用含F(xiàn)ura－2／AM的含鈣液孵育細(xì)胞，去酯化。將灌流槽放于倒置熒光顯微鏡上進(jìn)行觀察，并用340nm與380 nm波長的激發(fā)光激發(fā)Ca2＋熒光探針Fura－2發(fā)射熒光，用CCD拍攝熒光動(dòng)態(tài)變化并通過鈣熒光成像系統(tǒng)IPA software進(jìn)行分析，以340nm和380nm激發(fā)波長下熒光強(qiáng)度比值反映［Ca2＋］i。熒光強(qiáng)度越大，［Ca2＋］i越高。以上每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1．8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

收集各組細(xì)胞，預(yù)冷無鈣PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106／L。70%乙醇4℃固定24h后加入RNA酶（終濃度為50μg／mL），37℃反應(yīng)1h；100μg／mL碘化丙啶溶液染色20～30min后，流式細(xì)胞儀行單色熒光流式細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡率。

1．9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組間均數(shù)的比較采用F檢驗(yàn)，兩組間均數(shù)的比較用t檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。

2 結(jié)果

2．1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測leptin蛋白的含量

leptin陽性染色呈黃～棕黃色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)。正常對照組、空載體組及siRNA對照組細(xì)胞著色呈強(qiáng)陽性（圖1A～C）；leptin－siRNA組呈弱陽性（圖1D）。計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)測量顯示：leptinsiRNA組的平均吸光度（A）值為（0．08±0．02），較正常對照組（0．13±0．01）明顯減弱，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）；空載體組為（0．12±0．01），siRNA對照組為（0．11±0．02），與正常對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0．05）。

圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測HSC細(xì)胞中l(wèi)eptin蛋白表達(dá)（SP法，×400）Fig．1 Expression of leptin protein detected by immunocytochemistry（SP method，×400）

2．2 Western blot分析leptin蛋白的表達(dá)

從圖2可見leptin－siRNA組蛋白條帶亮度明顯低于正常對照組、空載體組和siRNA對照組。以leptin／β－actin灰度值比值反映leptin蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示：正常對照組為（1．04±0．01），空載體組為（1．02±0．02），兩組leptin蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；siRNA對照組為（1．00±0．02），與正常對照組相比差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；leptin－siRNA組為（0．90±0．03），明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

圖2 leptin－siRNA抑制HSC中l(wèi)eptin蛋白的表達(dá)Fig．2 Inhibition of leptin protein expression by leptin－siRNA in HSC

2．3 細(xì)胞活性檢測

以正常對照組細(xì)胞增殖抑制率為0，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖抑制率。Leptin－siRNA組與正常對照組、空載體組和siRNA對照組相比，增殖抑制率明顯升高（均P＜0．05），且隨著時(shí)間增加（24、48、72 h），增殖抑制率逐漸升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。見表1。

表1 Leptin－siRNA轉(zhuǎn)染后各時(shí)點(diǎn)HSC增殖抑制率（±s，%）Table 1 Proliferation inhibition rates of HSC after leptin－siRNA transfection（±s，%）

表1 Leptin－siRNA轉(zhuǎn)染后各時(shí)點(diǎn)HSC增殖抑制率（±s，%）Table 1 Proliferation inhibition rates of HSC after leptin－siRNA transfection（±s，%）

與leptin－siRNA組比較，＊P＜0．05；與leptin－siRNA轉(zhuǎn)染24h比較，＃P＜0．05；與leptin－siRNA轉(zhuǎn)染48h比較，△P＜0．05

組別24h 48h 72h正常對照組 0．00＊ 0．00＊ 0．00＊空載體對照組 3．78±0．45＊ 6．70±0．34＊ 6．77±0．75＊siRNA對照組 4．22±0．32＊ 6．20±0．92＊ 5．47±0．54＊leptin－siRNA組16．51±2．10 21．47±1．87＃ 30．50±1．32＃△

2．4 細(xì)胞周期及凋亡率分析

根據(jù)DNA含量直方圖分析轉(zhuǎn)染48h后HSC細(xì)胞周期各時(shí)相比率，分析結(jié)果表明，leptin－siRNA組的細(xì)胞周期有顯著變化，出現(xiàn)明顯的G1和G2期阻滯，表現(xiàn)為G1和G2期細(xì)胞增多，而S期細(xì)胞明顯減少，從而導(dǎo)致HSC的有絲分裂延遲（表2）。各組細(xì)胞凋亡檢測顯示：空白對照、空載體對照組和siRNA對照組凋亡細(xì)胞數(shù)少，而leptin－siRNA組細(xì)胞凋亡比例高達(dá)為（53．60±10．11）%，明顯高于其它各組（均P＜0．01），見圖3、表3。

2．5 細(xì)胞內(nèi)［Ca2＋］i測定

以340nm和380nm激發(fā)波長下熒光強(qiáng)度比值反映［Ca2＋］i。與正常對照組相比，空載體和siRNA對照組的熒光強(qiáng)度無明顯變化，HSC中［Ca2＋］i變化不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）。Leptin－siRNA組熒光強(qiáng)度明顯減弱，說明 HSC中［Ca2＋］i下降，與其它各組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。見表3。

表2 Leptin－siRNA轉(zhuǎn)染后對HSC細(xì)胞周期的影響（±s，%）Table 2 Effect of leptin－siRNA transfection on cell cycle in HSC（±s，%）

表2 Leptin－siRNA轉(zhuǎn)染后對HSC細(xì)胞周期的影響（±s，%）Table 2 Effect of leptin－siRNA transfection on cell cycle in HSC（±s，%）

與leptin－siRNA組比較，＊＊P＜0．01

組別 G0／G1期 G2／M期 S期正常對照組 47．45±4．68＊＊ 10．65±3．01＊＊ 32．01±2．38＊＊空載體組 59．11±11．02＊＊16．42±8．01＊＊ 28．45±4．20＊＊siRNA對照組 64．48±6．63＊＊ 18．55±2．37＊＊ 29．15±3．56＊＊leptin－siRNA組75．49±4．61 26．91±2．01 8．60±2．00

圖3 流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染48h后HSC凋亡Fig．3 Flow cytometric analysis of HSCs 48hafter transfection with different siRNAs

表3 Leptin－siRNA轉(zhuǎn)染48h后對HSC凋亡率和鈣離子濃度的影響（±s，n＝5）Table 3 Apoptosis rate and［Ca2＋］iof HSC 48hafter leptin－siRNA transfection（±s，n＝5）

表3 Leptin－siRNA轉(zhuǎn)染48h后對HSC凋亡率和鈣離子濃度的影響（±s，n＝5）Table 3 Apoptosis rate and［Ca2＋］iof HSC 48hafter leptin－siRNA transfection（±s，n＝5）

與leptin－siRNA組比較，＊P＜0．05＊＊P＜0．01

組別 凋亡率（%） 熒光強(qiáng)度正常對照組 1．03±0．11＊＊ 1 032．01±42．56＊空載體組 4．68±0．35＊＊ 938．11±55．30＊siRNA對照組 4．37±0．24＊＊ 859．15±33．56＊leptin－siRNA組53．60±10．11 604．61±165．20

3 討論

肝纖維化的形成主要是由于HSC激活，ECM在肝內(nèi)大量沉積所致。氧化應(yīng)激、炎癥、EMC的改變等因素可刺激HSC活化。在肝纖維化形成過程中，HSC數(shù)量是增多的，而在肝纖維化的逆轉(zhuǎn)過程中其數(shù)量是減少的［1］。促進(jìn) HSC細(xì)胞凋亡、減少HSC數(shù)量、減少ECM已成為肝纖維化治療的新策略［8－9］。Tang等［10］證 實(shí)leptin作 用 下 Ⅰ 型 前 膠 原mRNA水平增高；Leclercq等［11］發(fā)現(xiàn)leptin缺乏的ob／ob小鼠肝纖維化程度顯著降低；臨床實(shí)驗(yàn)表明leptin可能參與酒精性肝硬化［12］。因此，可以推斷l(xiāng)eptin參與了各種肝病的肝纖維化病理進(jìn)程。而目前有關(guān)leptin對HSC活性的影響尚不明確。

本研究構(gòu)建了leptin－siRNA，免疫細(xì)胞化學(xué)法及 Western blot檢測顯示leptin－siRNA可以沉默leptin基因表達(dá)，證實(shí)leptin－siRNA構(gòu)建成功。leptin－siRNA轉(zhuǎn)染HSC后，細(xì)胞生長受到抑制，細(xì)胞毒性分析（MTT法）顯示leptin－siRNA組增殖抑制率明顯升高（P＜0．05），且隨著時(shí)間延長，增殖抑制率逐漸升高。流式細(xì)胞檢測表明leptin－siRNA可阻滯細(xì)胞于G1和G2期，S期細(xì)胞明顯減少，從而導(dǎo)致細(xì)胞的有絲分裂延遲。同時(shí)，leptin－siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可使細(xì)胞凋亡率升高（P＜0．01），提示lep－tin可影響HSC活性，leptin表達(dá)的下調(diào)或缺失可抑制HSC的增殖，促進(jìn)HSC的凋亡，進(jìn)而可能抑制肝纖維化的進(jìn)程。

Ca2＋作為重要的細(xì)胞內(nèi)信使，參與細(xì)胞多種生理活動(dòng)的調(diào)控?；罨腍SC鈣通道大量開放，使得［Ca2＋］i增加，增加［Ca2＋］i與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，后者引起細(xì)胞收縮，細(xì)胞收縮使竇腔狹窄限制肝竇血流，增加肝內(nèi)血管阻力，有利于門脈高壓形成［3］。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，leptin－siRNA 組［Ca2＋］i明顯降低，因而推測leptin－siRNA可使HSC的收縮受到抑制。

總之，leptin表達(dá)在肝纖維化發(fā)生中起重要作用，利用 RNA 干擾技術(shù)，將leptin－siRNA 轉(zhuǎn)染HSC后能明顯降低leptin蛋白表達(dá)、抑制細(xì)胞內(nèi)［Ca2＋］i、抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為進(jìn)一步以leptin為靶點(diǎn)的肝纖維化的基因靶向治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］ Friedman S L．Seminars in medicine of the Beth Israel Hospital，Boston．The cellular basis of hepatic fibrosis．Mechanisms and treatment strategies［J］．N Engl J Med，1993，3289（25）：1828－1835．

［2］ Friedman S L．Molecular regulation of hepatic fibrosis，an in－tergrated cellular response to tissue injury［J］．J Biol Chem，2002，275（4）：2247－2250．

［3］ Yee H F Jr．Ca2＋and rho signaling pathways：Two paths to hepatic stellate cell contraction［J］．Hepatology，2001，33（4）：1007－1008．

［4］ Hourigan L F，Macdonald G A，Purdie D，et al．Fibrosis in chronic hepatitis C correlates significantly with body mass index and steatosis［J］．Hepatology，1999，29（4）：1215－1219．

［5］ Anania F A．Leptin，liver，and obese mice－fibrosis in the fat lane［J］．Hepatology，2002，36（1）：246－248．

［6］ Marra F．Leptin and liver fibrosis：a matter of fat［J］．Gastroenterology，2002，122（5）：1529－1532．

［7］ Paddison P J，Caudy A A，Hannon G J．Stable suppression of gene expression by RNAi in mammalian cells［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2002，99（3）：1443－1448．

［8］ Oakley F，Meso M，Iredale J P，et al．Inhibition of inhibitor of kappaB kinases stimulates hepatic stellate cell apotosis and accelerated recovery from rat liver fibrosis［J］．Gastroenterology，2005，128（1）：108－120．

［9］ 黃加權(quán)，焦云桃，李蘭，等．siRNA干預(yù)CTGF和TIMP－1對大鼠肝星狀細(xì)胞膠原分泌的影響［J］．華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，41（1）：22－26．

［10］ Tang M，Potter J J，Meze E．Leptin enhances the effect of transforming growth factor beta in increasing typeⅠcollagen formation［J］．Biochem Biophs Res Commun，2002，297（4）：906－911．

［11］ Leclercq I A，F(xiàn)arrell G C，Schriemer R．Leptin is essential for the hepatic fibrogenic response to chronic liver injury［J］．J Hepatol，2002，37（2）：206－213．

［12］ Schudoma C，May P，Nikiforova V，et al．Sequence－structure relationships in RNA loops：establishing the basis for loop homology modeling［J］．Nucleic Acids Res，2010，38（3）：970－980．