杭蘇琴，時祺，丁立人，朱偉云

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)消化道微生物研究室，江蘇 南京210095）

仔豬斷奶是以母乳喂養(yǎng)為主向以固體飼料為主轉(zhuǎn)變的過程，在此期間日糧、環(huán)境的變化及宿主的不適應(yīng)都會引起腸道微生態(tài)發(fā)生變化，極易導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)腹瀉、體重下降，甚至致死［1－2］，抗生素類產(chǎn)品因其既能抑制病原微生物的增殖又能促進動物機體的生長而被廣泛地用于斷奶仔豬日糧中［3］，但近年來耐藥菌株的大量出現(xiàn)和藥殘問題的日益突出，尋找抗生素的替代品迫在眉睫。功能性低聚糖和纖維類飼料，因可選擇性地促進腸道內(nèi)雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌的增殖，抑制大腸桿菌等有害菌的生長，產(chǎn)生大量乳酸和揮發(fā)性脂肪酸（votile fatty acids，VFAs），改善腸道微生態(tài)環(huán)境，進而促進動物腸道健康，發(fā)揮益生作用而在動物生產(chǎn)中備受關(guān)注［4－9］。果寡糖（FOS）是斷奶仔豬生產(chǎn)中使用較多的低聚糖之一，F(xiàn)OS是蔗糖分子以β－1，2－糖苷鍵結(jié)合幾個（8個以下）D－果糖而形成的寡糖，果寡三糖，果寡四糖和果寡五糖是最常見的飼料添加劑形式［10］。王亞軍等［11］報道，斷奶仔豬日糧中添加0．2%果寡糖便能顯著提高日增重和采食量，降低料重比及腹瀉的發(fā)生；車向榮等［12］報道，35日齡仔豬日糧中添加果寡糖可顯著提高外周血T淋巴細胞數(shù)和IgG水平，F(xiàn)OS組仔豬腹瀉率降低了66%；Mikkelsen和Jensen［13］報道，28日齡的斷奶仔豬飼喂FOS后后腸丁酸濃度顯著提高，乙酸濃度顯著降低，即FOS改變了微生物的發(fā)酵方式；Trevisi等［14］報道，斷奶仔豬日糧中添加2%的FOS促進了Toll樣受體2和4（Toll－like Receptor，TLR2和TLR4）及腫瘤壞死因子的表達，發(fā)揮了免疫調(diào)節(jié)作用。但是并不是所有的研究者都發(fā)現(xiàn)了FOS的積極作用，Mikkelsen等［15］報道，斷奶仔豬日糧中添加40g／kg FOS沒有促進動物的生長，不能促進斷奶仔豬腸道雙歧桿菌和乳酸桿菌等有益菌的增殖和VFAs濃度的增加，認為FOS的添加劑量和仔豬年齡與此有關(guān)。上述研究均集中在斷奶后仔豬，且關(guān)注的是FOS對仔豬生長性能、腸道微生物區(qū)系和有機酸濃度等的影響，而仔豬的生長與消化道的發(fā)育、消化酶的分泌有直接關(guān)系，可是斷奶前仔豬開食料中添加FOS對腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)、消化酶分泌、有機酸濃度及乳酸桿菌菌群等影響的報道卻很少，故本研究通過在7～23d仔豬開食料中添加FOS，研究FOS對仔豬腸道發(fā)育、消化酶和乳酸桿菌菌群的影響，探討FOS作為斷奶前仔豬開食料調(diào)控劑用于緩解斷奶應(yīng)激的可能性。

1 材料與方法

1．1 試驗動物與設(shè)計

2010年12月于江蘇省某豬場選擇出生日齡、胎次相近的6窩健康新生杜長大仔豬，隨機分為對照組開食料（對照組）和實驗組開食料＋1%FOS（FOS組），每組3個重復(fù)。FOS（廣東江門量子高科生物股份有限公司）純度高于90%。仔豬開食料配方及營養(yǎng)水平見表1。試驗于仔豬7d開始至23d（斷奶）結(jié)束，分別于試驗開始和結(jié)束時，每窩隨機選擇1頭健康仔豬屠宰采樣。試驗期間仔豬飼養(yǎng)于半封閉、漏縫地板式豬舍，自然采光，每天清掃，保持清潔衛(wèi)生，試驗期間自由采食、飲水。

1．2 樣品采集與處理

頸靜脈放血處死仔豬，打開腹腔取出胃腸道，按組織學(xué)區(qū)分各腸段，收集如下樣品。

空、回腸組織樣：剪取空、回腸組織各2cm，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂去腸內(nèi)容物后，置組織樣于4%多聚甲醛中常溫下充分固定，用于制作常規(guī)石蠟切片測定小腸絨毛高度和隱窩深度。

胰臟組織樣和十二指腸內(nèi)容物：摘取胰臟，剝除脂肪和結(jié)締組織；分離十二指腸取內(nèi)容物，液氮中保存胰臟和十二指腸內(nèi)容物，用于脂肪酶、胰蛋白酶、淀粉酶活性測定。

胃、回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物：取各部位內(nèi)容物2 mL－20℃保存，用于VFAs和乳酸濃度測定。

1．3 指標(biāo)測定及方法

空、回腸組織絨毛高度和隱窩深度測定：切片后，常規(guī)HE染色，每頭豬、每個腸段制5張切片，利用圖像分析系統(tǒng)對仔豬空腸、回腸的絨毛高度和隱窩深度進行測量，每張切片中至少選取5個視野進行計量。

表1 斷奶前仔豬開食料配方和營養(yǎng)水平 （風(fēng)干基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of starter feeds in unweaned piglets（air－dry basis）

胰蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力測定：采用試劑盒（南京建成生物工程有限公司）的方法，嚴(yán)格按照說明書操作。

VFAs和乳酸含量測定：島津GC－14B型氣相色譜儀測定VFAs濃度［16］；試劑盒（南京建成生物工程有限公司）的方法測定乳酸濃度。

PCR／DGGE和Real time PCR技術(shù)分析乳酸桿菌菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量，提取23d胃、回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物總DNA［17］，用于擴增乳酸桿菌特異的16SrRNA 基因片段［18］，擴增產(chǎn)物進行 DGGE（denaturing gel gradient electrophoresis，變性梯度凝膠電泳法）。DGGE用8%聚丙烯酰胺凝膠，尿素濃度梯度為35%～45%，首先200V電泳10min，然后85V電泳12h，電泳結(jié)束后進行硝酸銀染色［18］。DGGE凝膠經(jīng)掃描（GS－800，Bio－Rad）后，用分子分析家軟件包（Molecular Analyst，Bio－Rad）進行條帶數(shù)、相似性和多樣性分析。乳酸桿菌定量分析（Real time PCR）的引物及反應(yīng)條件均參照文獻［19］，以本實驗室自行分離自仔豬腸道的乳酸桿菌Lactobacillussp．S1為模板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步處理后，采用SPSS（16．0）中的獨立t檢驗進行差異顯著性分析，以P＜0．05作為顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。數(shù)據(jù)以3個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2．1 FOS對斷奶前仔豬小腸形態(tài)發(fā)育的影響

由表2看出，23d時FOS組仔豬空、回腸絨毛高度均高于對照組，回腸絨毛高度顯著高于對照組（P＜0．05），空、回腸絨毛高度與隱窩深度之比也顯著高于對照組（P＜0．05），但兩組仔豬空、回腸隱窩深度差異不顯著。

表2 FOS對斷奶前仔豬小腸粘膜形態(tài)的影響Table 2 Effect of FOS on mucosal morphology of unweaned piglets

2．2 FOS對斷奶前仔豬胰腺和十二指腸酶活性的影響

表3為23d時胰臟和十二指腸中酶的活性，F(xiàn)OS組仔豬胰腺、十二指腸中脂肪酶和蛋白酶活性雖高于對照組，但差異不顯著（P＞0．05），而淀粉酶活性FOS組仔豬顯著高于對照組（P＜0．05）。

表3 FOS對斷奶前仔豬胰腺和十二指腸酶活性的影響Table 3 Effects of FOS on the enzyme activity in pancreas and duodenum of unweaned piglets

2．3 FOS對斷奶前仔豬胃腸道內(nèi)容物中VFAs和乳酸濃度的影響

表4為仔豬23d時胃腸道各部位VFAs及乳酸濃度，F(xiàn)OS組仔豬胃腸道各部位乙酸和TVFA濃度均顯著高于對照組 （P＜0．05），回腸和結(jié)腸丙酸濃度顯著高于對照組（P＜0．05），盲腸中丁酸濃度顯著高于對照組（P＜0．05）。乳酸結(jié)果顯示，F(xiàn)OS組仔豬胃中乳酸濃度顯著低于對照組（P＜0．05），回腸和盲腸乳酸濃度雖低于對照組，但差異不顯著（P＞0．05）。

腸道各部位乙酸、丙酸和丁酸占TVFA比例表現(xiàn)一定差異性（數(shù)據(jù)未列出），對照組和FOS組胃中乙酸比分別為83．9%和82．8%，丙酸比為12．2%和14．4%，丁酸比為3．9%和2．6%；回腸中乙酸比分別為91．2%和90．4%，丙酸比為4．5%和5．6%，丁酸比為4．3%和4．0%；結(jié)腸中乙酸比分別為70．4%和77．9%，丙酸比為18．7%和14．6%，丁酸比為10．9%和7．4%；盲腸中乙酸比分別為72．3%和73．5%，丙酸比為19．2%和16．3%，丁酸比為7．8%和9．5%。由此看出，相對于胃和回腸，結(jié)腸和盲腸乙酸比下降、丙酸和丁酸比上升，回腸和胃也略有差異，回腸表現(xiàn)為丙酸比急劇下降、丁酸比大幅上升，上述變化在兩組之間差異不明顯。

表4 FOS對斷奶前仔豬胃腸道VFAs和乳酸濃度的影響Table 4 Effects of FOS on VFAs concentration in gastrointestinal tract contents of unweaned piglets mmol／L

2．4 FOS對斷奶前仔豬消化道中乳酸桿菌菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的影響

圖1為23d時仔豬胃腸道內(nèi)容物中乳酸桿菌的變性梯度凝膠電泳（DGGE）圖譜，兩組仔豬胃、回腸、結(jié)腸和盲腸都有共有條帶1，但條帶2和3只出現(xiàn)在FOS組仔豬，說明FOS對乳酸桿菌菌群有一定影響。圖譜經(jīng)聚類分析發(fā)現(xiàn)，胃和回腸乳酸桿菌根據(jù)相似程度分為明顯的4簇（圖2a），同部位、同組的3頭仔豬乳酸桿菌相似性較高歸為1簇（對照組仔豬c回腸除外），說明腸道部位和組別對乳酸桿菌菌群有較大影響，但也能看出，相同部位對照組和FOS組仔豬乳酸桿菌相似性也較高；在盲腸和結(jié)腸（圖2b），乳酸桿菌菌群也表現(xiàn)了組別和腸道部位的差異，此時同組、不同部位的乳酸桿菌相似性較高，如對照組仔豬盲腸和結(jié)腸歸為1簇（相似性約62%），F(xiàn)OS仔豬盲腸和結(jié)腸歸為1簇（相似性約70%），2簇之間相似性約57%。DGGE圖譜多樣性分析結(jié)果表明（圖3），F(xiàn)OS組仔豬胃、回腸、盲腸和結(jié)腸乳酸桿菌菌群多樣性指數(shù)均高于對照組，在胃和盲腸FOS組顯著高于對照組（P＜0．05）。定量分析仔豬胃腸道中乳酸桿菌，結(jié)果表明（圖4），F(xiàn)OS組仔豬每g胃內(nèi)容物中乳酸桿菌拷貝數(shù)低于對照組，每g回腸、盲腸和結(jié)腸內(nèi)容物中乳酸桿菌拷貝數(shù)高于對照組，但差異不顯著（P＞0．05）。

3 討論

3．1 FOS對斷奶前仔豬小腸形態(tài)的影響

小腸是機體消化、吸收營養(yǎng)物質(zhì)的重要場所，絨毛高度與隱窩深度反映了腸道的功能狀況。本研究顯示，F(xiàn)OS組仔豬空、回腸絨毛高度均高于對照組（回腸差異顯著），兩組隱窩深度差異雖不顯著，但FOS組仔豬絨毛高度與隱窩深度之比均顯著高于對照組，說明FOS組仔豬小腸絨毛受損程度低于對照組，仔豬開食料中添加FOS可有效緩解固體日糧對小腸絨毛的損傷，利于仔豬消化吸收營養(yǎng)物質(zhì)。據(jù)文獻報道，F(xiàn)OS減少絨毛受損的原因可能與腸道細胞的增殖、上皮更新和微生物區(qū)系的改變有關(guān)［20－21］，但具體機制尚不清楚。

3．2 FOS對斷奶前仔豬消化酶活性的影響

斷奶豬消化道分泌酶能力減弱和酶活性降低可影響?zhàn)B分的消化和吸收。本實驗結(jié)果表明，F(xiàn)OS顯著提高了斷奶前仔豬胰腺和十二指腸淀粉酶活性，提高了脂肪酶、蛋白酶活性。Xu等［20］報道，生長豬每kg日糧中添加4或6g FOS時十二指腸胰蛋白酶、淀粉酶和總蛋白酶活性顯著提高，但對胰臟酶的活性無影響，他認為酶活性的提高與FOS促進雙歧桿菌和乳酸桿菌的增殖有關(guān)，因為這些有益菌能釋放酶并促進酶活的提高［22］。本研究雖未測定雙歧桿菌的變化，但也發(fā)現(xiàn)FOS能促進某些種類乳酸桿菌的富集，這可能是消化酶活性提高的部分原因。Gao［23］報道，消化酶活性與腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)也有關(guān)系，當(dāng)病原微生物如大腸桿菌較高時，腸道絨毛易受損也會抑制消化酶的分泌和活性，本研究FOS組仔豬絨毛受損程度低于對照組，對消化酶的抑制作用相對也較小。還有研究報道，消化道的長度、食糜通過腸道的速度和FOS的粘度都會影響消化酶的活性［24］。

圖1 23d仔豬消化道不同部位內(nèi)容物中乳酸桿菌的DGGE圖譜Fig．1 DGGE profiles of lactobacillus community obtained from gastrointestinal tract contents of unweaned piglets on 23days

圖2 23d仔豬胃和回腸（a）、結(jié)腸和盲腸（b）內(nèi)容物中乳酸桿菌DGGE圖譜相似性分析Fig．2 Similarity in DGGE patterns of lactobacillus community obtained from stomach and ileal（a），colonic and cecal（b）contents of unweaned piglets on 23days

圖3 FOS對仔豬胃腸道各部位乳酸桿菌多樣性指數(shù)的影響Fig．3 Effect of FOS on diversity indices of lactobacillus in gastrointestinal tract contents of unweaned piglets on 23days

圖4 23d仔豬胃腸道中乳酸桿菌的數(shù)量 （拷貝數(shù)／g濕重）Fig．4 The number of lactobacillus in gastrointestinal tract contents of unweaned piglets on 23days（copies／g wet weight）

3．3 FOS對斷奶前仔豬胃腸道內(nèi)容物中VFAs和乳酸含量的影響

寡糖能被腸道微生物發(fā)酵或部分發(fā)酵后產(chǎn)生VFAs，這些小分子酸可為動物提供能量、抵御病原微生物和維持腸道健康［25－26］。本研究結(jié)果顯示，兩組仔豬盲腸和結(jié)腸中乙酸、丙酸、丁酸和TVFA均明顯高于胃和回腸，其原因與前、后腸微生物數(shù)量、種類及微生態(tài)環(huán)境不一致所導(dǎo)致的近端腸道乳酸發(fā)酵為主，遠端腸道VFAs為主有關(guān)，有報道表明豬前、后腸中的微生物數(shù)量分別為108和1011cfu／g。結(jié)果還顯示，F(xiàn)OS促進了仔豬胃腸道中乙酸、丙酸、丁酸和TVFA產(chǎn)生，其中FOS組乙酸和TVFA濃度在上述4個部位中均顯著高于對照，F(xiàn)OS組仔豬回腸和結(jié)腸丙酸濃度顯著高于對照，F(xiàn)OS組仔豬盲腸丁酸濃度顯著高于對照，說明FOS在胃腸道能被微生物代謝利用產(chǎn)生更多的VFAs，但由于不同腸道部位優(yōu)勢微生物種類和數(shù)量不同導(dǎo)致VFAs濃度表現(xiàn)部位差異性，本研究中VFAs占TVFA比例在腸道各部位的變化也充分反映了這一現(xiàn)象。Duncan等［27］報道人和動物后腸中含有大量Eubacteriumrectale，Roseburiaintestinalis和Faecalibacteriumprausnitzii，這些微生物能把乳酸或乙酸轉(zhuǎn)化為丁酸，本研究中出現(xiàn)的對照組和FOS組結(jié)腸和盲腸乳酸濃度低、乙酸比下降、丙酸比和丁酸比上升（相對于胃和回腸）可能與這些微生物將乳酸和乙酸轉(zhuǎn)化為丁酸有關(guān)，此時丁酸比例上升可能是乙酸和乳酸共同轉(zhuǎn)化的結(jié)果，而丙酸比例的上升可能與乳酸的轉(zhuǎn)化有關(guān)［28］。但Houdijk等［4］的研究卻沒有發(fā)現(xiàn)FOS促進后腸有機酸產(chǎn)生的效果，這與FOS的添加劑量和仔豬的年齡有關(guān)。

3．4 FOS對斷奶前仔豬胃腸道中乳酸桿菌菌群結(jié)構(gòu)和數(shù)量的影響

研究表明，仔豬出生后乳酸桿菌很快便在腸道內(nèi)定植并成為優(yōu)勢菌伴隨仔豬一生，非消化性寡糖（如果寡糖）可選擇性地促進這類有益菌增殖［29］，而被用于仔豬斷奶時的日糧調(diào)控。本研究表明，在胃、回腸、盲腸和結(jié)腸FOS組都出現(xiàn)了2條對照組沒有的條帶，DGGE圖譜中的條帶主要反映優(yōu)勢菌的種、屬關(guān)系，說明FOS可選擇性地促進乳酸桿菌菌群中某些種類的細菌增殖、富集，多樣性分析也發(fā)現(xiàn)FOS組乳酸桿菌多樣性指數(shù)高于對照組，說明FOS通過這種選擇性地富集作用增加了乳酸桿菌種類的多樣性。乳酸桿菌定量結(jié)果顯示，盲腸和結(jié)腸乳酸桿菌數(shù)量明顯高于胃和回腸，說明乳酸桿菌定植有部位特異性，添加FOS后沒有明顯增加仔豬腸道中乳酸桿菌數(shù)量，說明FOS對乳酸桿菌菌群數(shù)量影響較小，對菌群種類的影響可能更大，但這種對某些種類乳酸桿菌選擇性地富集作用不能在菌群整體數(shù)量上反映。

綜上所述，F(xiàn)OS能促進斷奶前仔豬小腸消化吸收功能的發(fā)育，減緩固體飼料對腸壁損傷；在一定程度上提高消化酶活性和胃腸道內(nèi)容物中TVFA濃度；增加胃腸道中乳酸桿菌數(shù)量，提高乳酸桿菌菌群結(jié)構(gòu)的多樣性，促進菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，這些可能有利于提高仔豬對斷奶應(yīng)激的適應(yīng)能力，使仔豬更好地度過斷奶期。

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