何力志，石國民，胡方興

(1.湖南省第二人民醫(yī)院，湖南長沙410007;2.長沙市中心醫(yī)院，湖南長沙410004;3.長沙市第三醫(yī)院，湖南長沙410015)

隨著廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑及抗腫瘤藥物等的廣泛應用，侵襲性念珠菌病(invasive candidiasis，IC)的發(fā)病率逐年升高，病死率高達49%[1]。大量的臨床資料表明，IC的轉歸很大程度取決于早期診治，而現(xiàn)有的IC診斷指標存在一定的局限性[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)侵襲性真菌感染后人體內(nèi)可以檢測到一些特異性抗原或抗體成分?？拱啄钪榫抗芸贵w(anti-Candida albicans germ tube antibody，CAGTA)是一種保護性抗體，早期檢測有助于 IC 的診斷[3]，而1，3-β-D-葡聚糖(1，3-beta-D-glucan，BG)作為一種廣譜真菌標志物，對診斷IC的特異性和陽性預測值較高，但有一定假陽性[4]。因此，我們對BG和抗CAGTA進行聯(lián)合檢測，以探討其對IC的診斷和治療監(jiān)測的價值。

材料和方法

一、研究對象

收集2011年6月至2012年6月湖南省第二人民醫(yī)院、長沙市中心醫(yī)院及長沙市第三醫(yī)院血液科、呼吸科、重癥監(jiān)護病房(intensive care unit，ICU)、腫瘤科、腎內(nèi)科、老年科、兒科等疑診為IC的病例252例，其中男162例，女90例。IC診斷標準:按歐洲癌癥治療研究組織(European Organization for Research on Treatment of Cancer，EORTC)和美國國立變態(tài)反應與傳染病研究所霉菌病研究組(the United States National Institute of Allergy and Infectious Disease Research Institute Mycoses Study Group，NIAID-MSG)2007 年修訂的侵襲性真菌病(invasive fungal disease，IFD)診斷標準及國內(nèi)相關學會制定的各科侵襲性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)診治指南，參照文獻[5]，將IC診斷分為確診、臨床診斷、擬診及排除IC。符合以上確診或臨床診斷的患者為感染組(陽性者培養(yǎng)鑒定均為念珠菌)。定植組:為無深部真菌感染的基礎疾病或臨床表現(xiàn)的門診體檢者，每人的痰、糞、尿標本多次涂片鏡檢均未見菌絲或孢子，其中單一標本培養(yǎng)鑒定為念珠菌。

二、標本采集

每個疑診為IC的患者均進行影像學檢查、病原學檢查(血培養(yǎng)、痰培養(yǎng)、痰真菌涂片);部分患者行纖維支氣管鏡檢查，收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BAL)進行病原菌培養(yǎng)，以及經(jīng)支氣管肺活檢或計算機斷層掃描引導下肺穿刺行組織培養(yǎng)或病理學檢查，特殊患者留取腹腔和胸腔積液做真菌培養(yǎng)。定植組收集痰、糞、尿標本做直接鏡檢和培養(yǎng)。感染組患者在第1周靜脈采血2次，以后每周采血1次，全部患者連續(xù)監(jiān)測的時間為4周～2個月，或至患者死亡，或排除IC診斷為止。定植組患者采血次數(shù)同上。每個患者分別采取血清和肝素抗凝的血漿標本各2 mL，分離血清或血漿，凍存于-70℃冰箱備檢。分離菌株常溫保存。

三、抗真菌治療

感染組患者給予廣譜抗真菌治療，在接受治療2周后評價臨床癥狀、體征、放射學、病原學改變以及療效。

四、試劑與儀器

所用的API20C-AUX鑒定試劑、沙堡羅培養(yǎng)基均為法國梅里埃公司產(chǎn)品;MB-80微生物動態(tài)快速檢測系統(tǒng)、T01智能恒溫儀、冰浴槽以及GKT-5M Set動態(tài)真菌檢測試劑盒均為北京金山川科技發(fā)展公司產(chǎn)品。兔抗人多克隆IgG/異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)抗體為Sigma公司產(chǎn)品。

五、血BG檢測

取感染組和定植組的待檢血漿進行BG檢測，具體操作嚴格按說明書進行。廠家提供的對照血漿中真菌BG＜10 ng/L為正常，10～50 ng/L為可疑，≥50 ng/L為陽性。

六、間接免疫熒光法檢測抗CAGTA

首先制作具有芽管抗原的載玻片，然后制備孢子懸液，用于吸附感染組和定植組待檢血請中的孢子抗體。血清吸附后，再采用間接免疫熒光試驗檢測抗CAGTA。結果判定和具體操作參照文獻[6]進行。

七、統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。以感染組為真陽性，定植組為真陰性作四格表，分析評價抗CAGTA試驗和BG單獨以及二者聯(lián)合應用后診斷IC的敏感性、特異性、陽性預測值及陰性預測值。率的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、病例資料

確診為IC患者5例，臨床診斷為IC患者21例，感染組共計26例。定植組100例。

二、BG結果分析

確診為IC的5例患者BG均為陽性，臨床診斷為IC的21例患者中有11例BG為陽性。100例定植組中有10例BG陽性。BG對IC診斷的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別為61.5%、90.0%、61.5%、90.0%。

三、抗CAGTA結果分析

確診為IC的5例患者抗CAGTA均為陽性，臨床診斷為IC的21例患者中有10例抗CAGTA為陽性。100例定植組中有17例抗CAGTA陽性?？笴AGTA對IC診斷的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別為 57.7%、83.0%、46.9%、88.3%。

四、BG和抗CAGTA聯(lián)合檢測的診斷能力

感染組抗CAGTA陽性15例、BG陽性16例，其中14例為同一患者。當BG和抗CAGTA同時陽性時，2組試驗數(shù)據(jù)的動力學變化相一致。

當定植組抗CAGTA或BG出現(xiàn)陽性時，會出現(xiàn)抗GAGTA或BG含量突然上升的現(xiàn)象，然后隨著病程的推移，未經(jīng)抗真菌治療自動轉陰，見圖1、2。另外定植組無患者抗CAGTA和BG同時陽性，二者之間無對應性。

BG和抗CAGTA聯(lián)合檢測對IC診斷的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別為53.8%、100.0%、100.0%、89.3%，與單項檢測相比，敏感性、陰性預測值差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但特異性和陽性預測值均明顯提高(P ＜0.05)，均達100.0%。

圖1 定植組BG陽性時平均BG值變化

圖2 定植組抗CAGTA陽性時平均抗體值變化

五、抗真菌治療療效與抗CAGTA和BG含量變化的關系

感染組BG陽性16例，在接受抗真菌治療后，14例有效，2例無效。以采血時間第1、8、12、16、20、24、28、32、36、40 天各檢測點平均 BG 含量作圖，其變化趨勢見圖3。治療無效組BG值總體呈上升趨勢;治療有效組BG含量均值呈下降趨勢，最后達到正常。感染組抗CAGTA陽性15例，在接受抗真菌治療后，13例有效，2例無效。以各檢測點平均抗CAGTA含量作圖，其變化趨勢見圖4。從圖3、4可以看出，感染組抗真菌治療后，抗CAGTA與BG動力學變化規(guī)律一致。同時，結合臨床資料顯示，BG(第8天)和抗CAGTA(第12天)已開始呈現(xiàn)陽性，早于臨床抗真菌治療。

圖3 治療有效組與無效組的平均BG含量變化

圖4 治療有效組與無效組的平均抗CAGTA含量變化

討 論

IFI時，BG可從真菌細胞壁釋入血中，而淺表感染或定植時BG極少釋放入血。因此在人體液和組織中檢測到BG往往提示IFI[7]。目前，國內(nèi)外對BG的研究較多，其對IC的診斷作用日益明確。在EORTC/NIAID-MSG診斷IFD的標準中已將BG連續(xù)2次陽性作為陽性標準。本研究結果顯示BG對IC診斷的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別為 61.5%、90.0%、61.5%、90.0%。與 kondori等[8]的研究結果(BG 檢測的敏感性為70% ～100%、特異性為87% ～96%)有一定差距，但與武建國等[6]的報道(敏感性為63.6%、特異性為 90.8%)相近，可能由于所使用試劑盒及病例等不同所致。上述研究結果顯示BG診斷IC仍有一定的假陽性。據(jù)報道，菌血癥患者的假陽性率約60%，革蘭陽性球菌菌血癥高達73%[9]。其他引起假陽性的原因還包括:溶血、γ球蛋白或凝血因子、某些藥物干擾、血液透析用纖維素膜、暴露于含葡聚糖的面繃帶、中暑及其他未知原因等。

白念珠菌由酵母相轉變?yōu)榫z相過程中形成芽管。西班牙科學家首先在播散性白念珠菌患者的血清中檢測到芽管抗體，并證實了人們提出的芽管是白念珠菌由定植菌向致病菌轉變的標志?？笴AGTA診斷IC的總體敏感性為77%～89%，特異性為91% ～100%[10];在其他念珠菌如熱帶念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌等引起的侵襲性感染中也可呈現(xiàn)陽性反應[11]。盡管學者們對檢測抗體診斷IC一直存在疑慮:認為免疫功能受到抑制的患者可能檢測不出相應抗體，另外抗體陽性患者需排除真菌在體內(nèi)定植。但最近也有文獻報道，免疫功能低下家兔Western blot條帶多于免疫功能正常的家兔，其原因可能為前者的抗原清除能力減弱，反而刺激機體產(chǎn)生相應的抗體[12]。另有文獻報道，免疫功能低下的SC家兔產(chǎn)生抗烯醇化酶抗體的能力與免疫功能正常的SC家兔相似[13]。本研究結果顯示，免疫功能低下患者依然能產(chǎn)生抗體，抗CAGTA對IC診斷的敏感性、特異性、陽性預測值、陰性預測值分別達57.7%、83.0%、46.9%、88.3%。

本研究對BG和抗CAGTA進行聯(lián)合檢測，結果表明感染組中抗CAGTA陽性15例、BG陽性16例，其中14例為同一患者。定植組無一例患者抗CAGTA和BG同時陽性，二者之間無對應性;而且當抗CAGTA或BG陽性時，會出現(xiàn)二者含量突然上升，沒有經(jīng)抗真菌治療，隨病程推移自動轉陰的現(xiàn)象。這種差異具有重要意義，借此可以排除IC診斷的假陽性。BG和抗CAGTA聯(lián)合檢測診斷IC的敏感性、陰性預測值與單項檢測相比，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但特異性和陽性預測值明顯提高(P＜0.05)，分別達100.0%。這說明 BG和抗CAGTA聯(lián)合檢測明顯優(yōu)于單項檢測。

從圖3和圖4并結合臨床資料可以發(fā)現(xiàn)，在對感染組進行抗真菌治療前，BG(第8天)和抗CAGTA(第12天)已經(jīng)是陽性了。治療有效組隨著抗真菌治療時間的延長，BG和抗CAGTA含量逐漸下降;治療無效組BG和抗CAGTA含量呈持續(xù)上升趨勢。這說明動態(tài)檢測BG和抗CAGTA含量對臨床療效觀察和早期診斷具有一定意義，但具體應用價值仍待進一步研究。

綜上所述，聯(lián)合監(jiān)測BG和抗CAGTA不僅能提高IC診斷的特異性和陽性預測值，而且對IC的早期診斷和治療監(jiān)測具有潛在應用價值;同時也為實驗室無創(chuàng)、快速和特異地鑒定IC病原體提供了科學依據(jù)。

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