徐偉紅，徐 斌，范列英

(1.同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海200092;2.上海同仁醫(yī)院，上海200050;3.同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院，上海200040)

醫(yī)院感染爆發(fā)的定義是在短時(shí)間內(nèi)發(fā)生3例以上同種同源感染病例的現(xiàn)象。對同種同源病例的定義，臨床大多以細(xì)菌耐藥菌譜作為同源性分析的依據(jù)，一直以來缺乏有效、實(shí)用、適用的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測手段。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)耐藥株感染率近年來快速上升，除了與抗菌藥物的濫用有關(guān)，還與菌株的克隆傳播有很大關(guān)系[1]。我們收集了上海同仁醫(yī)院臨床分離的38株MRSA，采用mecA基因相關(guān)高變區(qū)(mecA gene related hyper-variable region，HVR)多態(tài)性分析對其進(jìn)行分型，了解其多態(tài)性分布狀況，為醫(yī)院感染爆發(fā)的確立提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

材料和方法

一、材料

1.標(biāo)本來源 38株MRSA菌株均來源于2013年7月至2013年9月上海同仁醫(yī)院的住院患者，非重復(fù)菌株。其中來自痰標(biāo)本20株、咽拭子9株、尿液4、膽汁3株、膿液和導(dǎo)管各1株。

2.實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 VITEK 2-COMPACT全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)及其配套的GP67藥敏板為法國梅里埃公司產(chǎn)品;血平板和MH平板購自上海伊華生物公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自上海之江生物公司;聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)試劑 Takara TaqTMHot Start Version購自寶生物工程(大連)有限公司;DNA Marker(100 bp ladder)購自北京TIANGEN生物技術(shù)有限公司;金黃色葡萄球菌 HVR-PCR引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。Veriti 96-Well PCR擴(kuò)增儀為ABI公司的產(chǎn)品;凝膠成像儀為TANON公司產(chǎn)品。

二、方法

1.細(xì)菌鑒定及藥敏 所有菌株均經(jīng)VITEK 2-COMPACT全自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定及體外藥敏分析。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923和金黃色葡萄球菌ATCC29213。

2.細(xì)菌DNA的提取 嚴(yán)格按上海之江生物公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因提取試劑盒說明書操作。

3.PCR引物 HVR引物序列根據(jù)文獻(xiàn)[2]。引物序列:P1為5’-ACTATTCCCTCAGGCGTCC-3’，P2 為 5’-GGAGTTAATCTACGTCTCATC-3’。

4.MRSA的HVR-PCR分型 取MRSA的菌株基因組DNA 1μL作為擴(kuò)增的模板，加入PCR反應(yīng)體系:HVR-PCR引物0.2μL(引物濃度為10 mmol/L)，10×PCR buffer 1μL，2.5 mmol/L dNTP 0.8μL，Taq 聚合酶0.05μL，滅菌去離子水6.95μL，反應(yīng)總體積為 10μL。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性1 min;94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸4 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行分析。

結(jié) 果

一、MRSA的HVR-PCR分型結(jié)果及HVR基因型的分布

MRSA的HVR-PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后可觀察到4種不同條帶，見圖1。根據(jù)這些條帶的不同(PCR產(chǎn)物片段大小)，38株MRSA被分為A、B、C、D 種基因型，其中以 C型23株(60.53%)，A型7株(18.42%)、B 型3 株(7.89%)、D 型2 株(5.26%)、未分型 3 株(7.89%)。C 型在各臨床科室均有分布，主要集中于老干部科。A、B、D和未分型則隨機(jī)分布在各臨床科室。見表1。

表1 MRSA的HVR基因型在各科的分布

圖1 MRSA的HVR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

二、MRSA的藥敏結(jié)果

MRSA對苯唑西林、青霉素的耐藥率為100%，對紅霉素、環(huán)丙沙星、克林霉素、莫西沙星、四環(huán)素、左氧氟沙星的耐藥率均在80%以上。對奎奴普汀/達(dá)福普汀、替加環(huán)素、萬古霉素的敏感率為100%，對利福平的敏感率為89.5%，利奈唑烷的敏感率為81.6%。見表2。

表2 MRSA對常用抗菌藥物的耐藥情況

討 論

由于MRSA抵抗力和毒力均較強(qiáng)，常存在多重耐藥，伴隨近年來分離率的增加，更被重視。在控制醫(yī)院感染方面，MRSA已經(jīng)成為主要的引起暴發(fā)流行的致病菌，因而尋找傳染源、切斷傳播途徑顯得尤為重要[3]。

MRSA是指表達(dá)mecA基因或具有其它耐藥機(jī)制如青霉素結(jié)合蛋白與苯唑西林的親和力改變的金黃色葡萄球菌[4]。mecA基因是耐甲氧西林葡萄球菌特有的[5]，而HVR與該基因緊密相連，存在于其下游，也具有特異性。mec基因高變區(qū)的dru序列是位于mecA與IS431 mec之間、長約2 040 bp的片段，由一個(gè)40 bp的片段重復(fù)1～9次構(gòu)成。在不同的MRSA菌株中dru重復(fù)次數(shù)不同，決定了MRSA基因的多態(tài)性，成為基因分型的分子基礎(chǔ)。本研究根據(jù)HVR長度多態(tài)性將38株MRSA分為4型，其中以C型多見(60.53%)，A 型7 株(18.42%)、B 型 3株(7.89%)、D 型 2株(5.26%)、未分型 3 株。王敏等[6]報(bào)道，用HVR-PCR方法將 MRSA按大小分為200、410、470、510及 600 bp共 5型，其中以 510 bp(61.25%)及 600 bp(21.25%)多見。曹鴻霞等[7]將安徽地區(qū)部分醫(yī)院分離的73株MRSA電泳后發(fā)現(xiàn)470～600 bp的3種基因型，以600 bp(58.8%)多見。說明MRSA的流行存在地區(qū)差異。本研究未發(fā)現(xiàn)200 bp的菌株，也可能是實(shí)驗(yàn)菌株較少的原因。同時(shí)本研究結(jié)果顯示MRSA呈嚴(yán)重且多重耐藥，對苯唑西林、青霉素的耐藥率100%，對紅霉素、環(huán)丙沙星、克林霉素、莫西沙星、四環(huán)素、左氧氟沙星的耐藥率都在80%以上。故首選抗生素治療藥物為萬古霉素、替加環(huán)素、奎奴普汀/達(dá)福普汀和替考拉寧。

MRSA主要通過接觸傳播，很容易在醫(yī)院環(huán)境內(nèi)流行，?？稍斐删植康貐^(qū)的爆發(fā)流行。因此本研究選擇了3個(gè)月內(nèi)分離的所有的MRSA菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A型分離出7株，在醫(yī)院內(nèi)呈散在分布;C型分離出23株，為本院MRSA流行株的優(yōu)勢型別，各科室流行株之間具有高度同源性，提示科室之間存在交叉感染現(xiàn)象，應(yīng)引起高度重視。C型集中于干部病房，表明MRSA菌株在干部病房內(nèi)存在克隆傳播。這與干部病房特殊的住院時(shí)間、用藥特點(diǎn)及環(huán)境的交叉感染有關(guān)[9]。

利用PCR技術(shù)對MRSA進(jìn)行分型的常用方法有隨機(jī)引物PCR、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性、特異功能集團(tuán)基因的多態(tài)性等分型方法[10]。mecA基因HVR長度多態(tài)性分型屬于特異功能集團(tuán)基因的多態(tài)性分型方法，只適合于MRSA菌株。本研究發(fā)現(xiàn)mecA基因HVR長度多態(tài)性分型在分型率、分辨力及結(jié)果上都較為可靠，可以為控制金黃色葡萄球菌感染提供詳實(shí)的流行病學(xué)資料，值得推廣。在MRSA流行病學(xué)研究中，往往會(huì)把幾種方法聯(lián)合使用，對MRSA的流行病學(xué)分析往往會(huì)更加準(zhǔn)確。

綜上所述，醫(yī)院應(yīng)采取嚴(yán)格的院內(nèi)感染控制措施，防止MRSA耐藥株在醫(yī)院不同病區(qū)內(nèi)的轉(zhuǎn)移。同時(shí)應(yīng)積極開展簡便、快速的MRSA分型檢測，尋找感染來源，對阻斷MRSA在醫(yī)院內(nèi)的爆發(fā)流行有重要的臨床意義。

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