胡玢婕，趙付菊，趙 虎

(復旦大學附屬華東醫(yī)院檢驗科，上海200040)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)是一種螺旋形、微需氧的革蘭陰性病原菌，其在人類胃表面黏膜上皮細胞和黏液層的長期定植是慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的主要發(fā)病原因，也是導致胃部惡性腫瘤以及黏膜相關性淋巴組織淋巴瘤(mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma，MALT)的重要危險因子[1]。流行病學研究顯示，盡管幽門螺桿菌相關疾病的發(fā)病率為15%，但世界范圍內一半以上的人口(在發(fā)展中國家高達80%)攜帶此菌[2]。幽門螺桿菌的難以根除和耐藥性菌株的日益增多存在多種原因，其耐藥性與其在感染部位形成生物膜(biofilm)的密切聯(lián)系已引起了廣泛關注。我們主要對幽門螺桿菌生物膜的結構和形成發(fā)展、其與耐藥機制的相關性以及臨床防治幽門螺桿菌持續(xù)難治性感染的研究進展做一綜述分析。

一、細菌生物膜的一般性質

細菌生物膜是細菌在生長過程中為適應生存環(huán)境而吸附于惰性或活性材料表面形成的一種與浮游態(tài)細菌相對應的生長方式[3]。生物膜細菌與浮游態(tài)細菌最主要的差別在于菌體排列緊密并包裹在自身分泌的胞外多糖基質(extracellular polymeric substance，EPS)內。這種基質能夠改變菌體的表面性質，從而促進菌體在活性表面初始的黏附，同時防止細菌的過度聚集。

生物膜的形成是細菌發(fā)育序列在相關基因嚴格調控下的表達過程，其生長周期包括最初的定植、不可逆的黏附、結構分化、發(fā)展成熟和解聚再定植5個階段[4]。在含有同種細菌的生物膜內，表層菌容易獲得營養(yǎng)和氧氣并排出代謝產(chǎn)物，具有旺盛的生命活動，而接近基質的深層菌則處于緩慢生長或不生長的休眠靜止狀態(tài)。細菌之間能夠通過菌體產(chǎn)物來實現(xiàn)信息傳遞，包括細菌素、高絲氨酸內酯、分泌蛋白等代謝產(chǎn)物和部分遺傳物質在內的信號分子能夠改變生物膜內的種群分布，改變相鄰細胞蛋白的表達，將某些遺傳特性(如耐藥性)傳遞給鄰近細胞。因此，細菌生物膜并不是簡單被動的表面黏附和細胞聚集，而是一種由基因組和環(huán)境互相影響決定的具有結構性、協(xié)調性和功能性的動態(tài)生物系統(tǒng)。

細菌生物膜的特性決定了其強大的環(huán)境適應能力。具有生物膜形成能力的細菌引起的機體持續(xù)性炎癥反應和組織損傷被認為是慢性感染形成或惡化的原因[5];同時，這種由生物膜細菌引起的感染可抵抗宿主自身防御系統(tǒng)的免疫效應，并且對抗菌藥物表現(xiàn)出逐漸增高的耐受能力[6]。

二、幽門螺桿菌生物膜的形成與發(fā)展

(一)幽門螺桿菌生物膜的組成成分

在Marshall和Warren首次成功培養(yǎng)和分離幽門螺桿菌[7]15 年后，Stark 等[8]觀察到幽門螺桿菌NCTC11637(ATCC43504)菌株在玻璃發(fā)酵瓶中生長時在氣液界面產(chǎn)生了一層不溶于水(含多糖)的被膜結構，證實了幽門螺桿菌同樣具有形成生物膜的能力。而在近期的一項研究中，研究人員對從消化道潰瘍患者分離的幽門螺桿菌TK1402株生物膜的掃描電鏡結果顯示，生物膜是細胞-細胞直接接觸聚集形成多分層結構的前體[9]。這種性質與具有典型生物膜結構的銅綠假單胞菌生長方式相似，同時也觀察到幽門螺桿菌生物膜中含有與銅綠假單胞菌生物膜基質中外膜囊泡(outer membrane vesicle，OMV)產(chǎn)物相類似的成分。

1.幽門螺桿菌生物膜中的蛋白質成分Yonezawa等[10]培養(yǎng)了8株不同的幽門螺桿菌，并提取其生物膜結構、分離OMV，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)條帶顯示了一種22 000蛋白的存在，這種蛋白在OMV培養(yǎng)的第2天才開始出現(xiàn)，且僅出現(xiàn)在TK1402株的SDS-PAGE條帶中。與此同時，他們測定了這種蛋白的N端氨基酸序列，測序結果顯示其N末端5個氨基酸殘基序列為[VDFSK]，但對于該蛋白鑒定、分離純化和化學性質分析的工作成果仍未見報道。另外，研究人員也發(fā)現(xiàn)OMV存在于細菌和基質的交界面以及生物膜胞外間隙，推測OMV在幽門螺桿菌生物膜基質的產(chǎn)生和其黏附于細胞表面的最初階段發(fā)揮了重要作用。

Yang等[11]選擇了幽門螺桿菌(ATCC 43504)進一步研究幽門螺桿菌生物膜的蛋白組成。該研究構建了生物膜部分蛋白質上調的缺失突變模型并對其特征進行描述，同時利用氣相色譜-質譜聯(lián)用(gas chromatograph-mass spectrometer-computer，GC-MS)和核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)分析萃取的胞外多糖;結果顯示一種1，4-甘露糖蛋白聚糖參與了生物膜的形成過程，而生物膜中粒細胞活化蛋白A(neutrophil-activating protein A，NapA)上調現(xiàn)象的存在使幽門螺桿菌表現(xiàn)出細胞聚集結構的減少和生物膜黏附能力的增強。

2.幽門螺桿菌生物膜中的糖類成分 檢測連續(xù)培養(yǎng)的幽門螺桿菌生物膜材料產(chǎn)物的實驗結果顯示，胞外多糖的產(chǎn)物具有很高的碳/氮比例[8]。粗提取幽門螺桿菌進行碳水化合物分析，C14和C16脂類、N-乙酰氨基葡萄糖、海藻糖、葡萄糖、半乳糖和甘油酸甘露庚糖等幽門螺桿菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的組成成分普遍存在。而另一項實驗表明，幽門螺桿菌在釋放OMV的同時，也會釋放空泡毒素(vacuolating cytotoxin，VacA)、脲酶、LPS和其他外膜蛋白于OMV表面，證實了幽門螺桿菌生物膜是蛋白質和碳水化合物相互依賴的復合基質，為細菌在胃外環(huán)境中的生存提供了“保護性港灣”[11]。

3.幽門螺桿菌生物膜中的遺傳物質 與大多數(shù)細菌生物膜含有遺傳物質成分相似，幽門螺桿菌生物膜中也存在一定數(shù)量的胞外DNA(extracellular DNA，eDNA)。Grande 等[12]利用DNA印跡法和隨機擴增多態(tài)性DNA聚合酶鏈反應(random amplification of polymorphic DNA-PCR，RAPD-PCR)分析培養(yǎng)2 d的幽門螺桿菌生物膜基質，首次發(fā)現(xiàn)了長度為 9 416 bp的 eDNA，而eDNA與胞內DNA具有不同的分子結構，表明eDNA釋放的最初來源并不是細胞溶解;另外他們在培養(yǎng)基中加入DNase I，但DNase I對生物膜的生長成熟并沒有顯著影響。因此eDNA不是幽門螺桿菌生物膜的主要組成部分，而是參與了基因重組的過程，從而造成種群基因的多樣性。eDNA在生物膜形成初期被OMV保護，有利于細菌之間活躍動態(tài)的信息交換，是基因水平轉移主要的信號分子。

(二)幽門螺桿菌生物膜形成的影響因素

對細菌生物膜形成動力學研究的大量實驗表明，細菌的自動聚集、運動性和疏水性是生物膜形成的重要因素[13-14]。然而，Yonezawa 等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，這些因素對生物膜形成能力很強的幽門螺桿菌TK1402菌株并沒有顯著的影響。而TK1402菌株在細胞過度生長時出現(xiàn)了生物膜合成的減少，但轉入含有7%胎牛血清的布氏肉湯中則恢復了很強的生物膜合成能力。因此可認為細菌生長是幽門螺桿菌生物膜合成的重要影響因素。

(三)幽門螺桿菌生物膜形成相關的密度感應系統(tǒng)

細菌生物膜的形成是一個動態(tài)演化過程。生物膜中的細菌在生長過程中會分泌一種或多種誘導分子到外環(huán)境中。隨著細菌數(shù)量的增加，其分泌信號分子的濃度也隨之增加。當濃度達到一定的閾值時可激發(fā)一系列特定的基因表達，以調節(jié)細菌的群體行為，這種現(xiàn)象稱為密度感應(quorum sensing，QS)[16]。QS 系統(tǒng)是細菌之間信號傳遞的一種重要機制，細菌通過感應這些誘導分子來判斷菌群密度和周圍環(huán)境變化，避免細菌因過度生長而造成空間和營養(yǎng)物質缺乏;更重要的是通過QS系統(tǒng)共同對周圍環(huán)境刺激做出反應，極大提高了整個細菌群體的生存能力[17]。

1.幽門螺桿菌中的QS系統(tǒng) 幽門螺桿菌中存在革蘭陽性和陰性細菌共同的LuxS/自身誘導素2(autoinducer-2，AI-2)QS系統(tǒng)。AI-2作為其信號分子具有高度保守性，能被不同種屬細菌識別，其合成主要依賴于在許多菌屬中序列保守的luxS基因編碼的LuxS蛋白酶[18]。AI-2以密度依賴性方式在菌體環(huán)境中積累存在。當AI-2增加到一定濃度時便可與luxS蛋白特異性結合并激活轉錄，從而調節(jié)一系列下游基因如化學感受體基因tlpB、化學轉換基因cheA和cagE IV型分泌基因的表達，從而促使一系列效應產(chǎn)物的生成。目前的研究已發(fā)現(xiàn)受體LuxQP途經(jīng)、ABC轉運子LsrB途經(jīng)和RbsB蛋白途經(jīng)3種AI-2的感應調控機制。但這些途經(jīng)的通路在幽門螺桿菌中的作用仍需更深入的實驗證實。關于AI-2在幽門螺桿菌中調節(jié)作用的最新報道來自Rader等[19]的研究，細菌通過化學感應受體tlpB將AI-2作為化學排斥劑來感應，這一作用與細菌的泳動功能相關。

2.QS系統(tǒng)在幽門螺桿菌生物膜形成中的作用 有研究顯示，當檢測一種多個基因發(fā)生特定突變的幽門螺桿菌菌株產(chǎn)生的生物膜效應時，luxS和cagE IV型分泌基因突變體形成的生物膜作用效率是野生型菌株的2倍[20]。分析其原因認為，luxS基因的突變增加了幽門螺桿菌特異性生物膜的形成;另一方面，cagE IV型分泌系統(tǒng)形成巨大的膜孔使得部分蛋白通過該系統(tǒng)分泌。但對于幽門螺桿菌的生存，cag毒力島并非必需，轉錄該操縱子所需的額外能量消耗阻礙了生物膜的有效形成，而對cag基因的破壞則可能造成膜表面pH值和疏水性的改變，使得突變體具有更強的黏附能力。由此可推斷l(xiāng)uxS和cagE基因之間存在著相互作用，表明一定數(shù)量的基因對于幽門螺桿菌形成的生物膜的重要性。

另外，為了驗證幽門螺桿菌感染導致的胃部疾病可能是生物膜頑固性的一種表現(xiàn)形式，Celini等[21]對幽門螺桿菌感染患者的胃組織進行了活檢。他們發(fā)現(xiàn)，在幽門螺桿菌大量 S形形態(tài)之中，也存在球形形態(tài)菌嵌入基質中。球形形態(tài)菌含有glmM組成型基因。在對幽門螺桿菌陽性患者樣本的逆轉錄PCR檢測顯示，所有glmM陽性的樣本LuxS群體效應相關基因同樣也是陽性。這也表明LuxS群體效應是幽門螺桿菌生物膜形成的可靠指標。

三、幽門螺桿菌生物膜的耐藥機制

根據(jù)目前的治療指南，幽門螺桿菌感染的根除治療主要有2種:含質子泵抑制劑(protonpumpinhibitor，PPI)和2種抗菌藥物(克拉霉素和阿莫西林)的三聯(lián)療法[22]或含PPI、鉍劑、四環(huán)素、甲硝唑的四聯(lián)療法[23]。然而，隨著幽門螺桿菌對甲硝唑和克拉霉素耐藥的增加，這一傳統(tǒng)三聯(lián)療法對幽門螺桿菌的根除率在全世界范圍內不斷下降。美國、南歐和部分亞洲國家對受試者意向治療(intention-to-treat，ITT)分析的大樣本臨床研究結果[24]顯示，該方案幽門螺桿菌根除率已下降至80%以下。大量研究表明，幽門螺桿菌生物膜的形成在很大程度上導致了耐藥菌株的增加，其耐藥機制主要有滲透與營養(yǎng)限制、對抗免疫防御系統(tǒng)、基因水平轉移和外排泵基因異常表達四種學說。

(一)滲透與營養(yǎng)限制

幽門螺桿菌生物膜基質的屏障作用是這一機制的關鍵。作為一種蛋白質和碳水化合物相互依賴的復合基質，幽門螺桿菌生物膜EPS帶有的大量陰離子能通過氫鍵、共價鍵、范德華力吸附部分帶有陽離子的抗菌藥物;另外，EPS含有多種抗菌藥物降解酶，導致抗菌藥物的水解和鈍化滅活[5]。

另一方面，生物膜結構的復雜性和其代謝活動造成深層菌不易獲得足夠的營養(yǎng)和氧氣，從而生長緩慢或處于休眠狀態(tài)。而大部分的抗生素主要針對代謝活躍的細菌，因此深層菌在很大程度上增強了幽門螺桿菌生物膜的耐藥性[25]。由于局部代謝產(chǎn)物的堆積使得深層菌處于偏酸的微環(huán)境中，需要中性理化環(huán)境的克拉霉素的抗菌活性在偏酸性的生物膜深層大大降低?？咕幬锬軌蚝芸斓馗韺泳５斖Ｋ幒?，殘存在深層的細菌可迅速繁殖形成新的生物膜，造成了臨床上感染的反復發(fā)作，難以治愈，也可能導致了生物膜對抗菌藥物耐受的遺傳性。

(二)對抗機體免疫防御系統(tǒng)

幽門螺桿菌生物膜的大量黏性基質形成物理屏障，限制了吞噬細胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生的活性氧產(chǎn)物滲透進入生物膜，導致吞噬細胞無法破壞生物膜內細菌[26]。另外，包裹細菌的黏性基質以及細菌釋放出的抗原性物質刺激機體產(chǎn)生大量的特異性抗體。這些抗體與可溶性抗原結合形成免疫復合物，沉積在感染病灶周圍，與黏附菌體誘導胃上皮細胞產(chǎn)生的白細胞介素8(interleukin 8，IL-8)[27]共同趨化大量中性粒細胞浸潤并釋放蛋白水解酶。這種免疫復合物效應能引起宿主嚴重的免疫損害[26]，但卻無法對生物膜中的細菌起作用。

(三)基因水平轉移(horizontal gene transfer，HGT)

HGT是指在細菌生物膜中兩個不同菌株之間的基因傳遞。細菌生物膜的環(huán)境決定了其中常包含一種或多種共生的物種，而這成為了連接QS系統(tǒng)和生物膜的紐帶。有研究表明，2個不同的幽門螺桿菌菌株共培養(yǎng)時會表現(xiàn)出更高的黏附能力，存在更高的遺傳異質性[28];另外，幽門螺桿菌也可能獲得其他物種誘導的防御機制，產(chǎn)生提高對宿主自然免疫殺傷耐受的外膜蛋白的能力，使得菌體下一代具有更好的適應性和更強的毒力[29]。

(四)外排泵基因異常表達

細菌通過外排泵將抗菌藥物排出是產(chǎn)生多重耐藥性的重要機制。大量對幽門螺桿菌耐藥菌株外排泵系統(tǒng)的研究顯示，外排泵基因 hp605、hp971、hp1327和hp1489及其相應mRNA的表達在生物膜中顯著上升[30]。這一發(fā)現(xiàn)表明幽門螺桿菌生物膜環(huán)境可能誘導了部分基因的異常表達，但機制尚未清楚。

四、針對幽門螺桿菌生物膜的防治策略進展

(一)N-乙酰半胱氨酸 (N-acetylcysteine，NAC)治療

NAC作為一種粘蛋白溶解劑和含硫醇的抗氧化劑，在對抗以銅綠假單胞菌為代表的生物膜細菌造成的慢性上呼吸道感染中已得到廣泛應用[31]。Cammarota等[32]開展了一項觀察 NAC 在耐藥幽門螺桿菌感染患者中療效的非盲隨機試驗。結果顯示，NAC處理組的幽門螺桿菌根除率高于對照組，且這一效應不受幽門螺桿菌基因型的影響。NAC雖沒有直接針對幽門螺桿菌的活性，但其能夠通過降低感染部位黏液的厚度使得其他抗菌藥物(蘭索拉唑+克拉霉素)更好地被遞送;另外，NAC可能干擾了細菌的抗原決定簇，使細菌暴露在酸性環(huán)境中，導致了抗原的退化;同時其也降低了黏膜上的氧化劑含量，使得幽門螺桿菌感染期間炎癥反應正常進行[33]。

(二)中藥制劑治療

有研究顯示了一些中藥制劑如大黃素、黃連素、苦參堿、黃芩苷等對耐藥幽門螺桿菌存在抑制作用，在低于50%最小抑菌濃度 (minimal inhibitory concentration，MIC)時，這些藥物能明顯抑制耐藥幽門螺桿菌生物膜形成[34-35]。其原因可能是中藥提取物含有的有機硫化合物能夠穿過細菌細胞壁磷脂雙份子層，更容易破壞生物膜結構的EPS，從而更好地滲入深層，起到殺菌作用。

(三)其他

Campli等[36]研究認為，低頻電場在幽門螺桿菌生物膜中能夠誘導黏附細菌表型的改變，降低細菌的黏附，使細菌種群失去平衡，從而降低幽門螺桿菌自身保護的能力。另外，由于QS信號系統(tǒng)在幽門螺桿菌生物膜中起中心調節(jié)作用，國內外學者設想它可能是一個控制感染性疾病的新靶點，希望通過它來對抗生物膜相關耐藥機制以達到治療目的，但其臨床意義有待進一步研究。

五、問題與展望

對于幽門螺桿菌生物膜的研究目前僅處在初始階段，有很多基礎問題有待解決，包括生物膜的形成機制、形成過程中所需的條件和信號、細菌胞外基質與宿主胞外基質直接的相互作用、QS系統(tǒng)的起始和靶基因表達調節(jié)與交叉交流、細菌群體的功能性分工等，特別是在耐藥機制和遺傳性狀方面更需要深入研究。目前，幽門螺桿菌生物膜形成的相關基因是這一領域的研究熱點。另一方面，用于預防幽門螺桿菌感染的高效無毒疫苗已通過了動物試驗[37]。這些都將為治療耐藥性幽門螺桿菌造成的臨床感染帶來希望。

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