文亞峰，韓文軍，周 宏

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2. 廣東省韶關(guān)市林業(yè)局，廣東 韶關(guān) 512000)

杉木Cunninghamia lanceolata是我國南方重要的用材林樹種，具有生長快、產(chǎn)量高、材質(zhì)好、用途廣等特點。但杉木分子遺傳學(xué)研究基礎(chǔ)非常薄弱，嚴(yán)重滯后于楊樹、桉樹、松樹等其他用材林樹種。就分子標(biāo)記開發(fā)而言，目前杉木研究所用的標(biāo)記類型仍以RAPD[1]、ISSR[2]、AFLP[3]等顯性標(biāo)記為主，微衛(wèi)星（SSR）標(biāo)記開發(fā)數(shù)量極為有限[4-5]，阻礙了杉木分子遺傳學(xué)研究的發(fā)展。共顯性標(biāo)記位點的開發(fā)將對杉木分子遺傳學(xué)研究產(chǎn)生很大促進作用。

與核基因組DNA相比，葉綠體基因組呈單親遺傳，保守性強，具有分子量小、多拷貝和結(jié)構(gòu)簡單等特點[6]?；诙毯塑账嶂貜?fù)序列而開發(fā)的葉綠體微衛(wèi)星（cp-SSR）是一種新型標(biāo)記技術(shù)，不僅具有SSR標(biāo)記的優(yōu)點，而且兼顧葉綠體基因組的特點，可用于植物群體遺傳分析、系統(tǒng)發(fā)育和細(xì)胞質(zhì)遺傳分析等[7-9]。杉木葉綠體基因組呈母性遺傳方式[10]，葉綠體微衛(wèi)星標(biāo)記還可為杉木優(yōu)良種子來源、母本繁殖、種子基因流檢測等提供強有力的技術(shù)手段。本文中以選自黑松和日本柳杉等的21個葉綠體微衛(wèi)星為候選位點，通過種（屬、科）間擴增為杉木篩選適合的標(biāo)記位點。

1 材料與方法

1.1 樣本材料

16個杉木優(yōu)樹單株（不同家系或無性系）用于檢測候選SSR位點、評估其多態(tài)性，其中12株（Y6, Y18, J5, J80, Ht14, Ht16, Jh10, Jh16, Y26,J18, Y110, Y1116）來源于湖南省攸縣杉木種子園（N27°18′, E113°47′），4 株（Lc6, Lc12, Lc18,Lc418）來源于廣東省樂昌市龍山杉木種子園（N25°12′, E113°28′）。不同杉木單株采嫩葉若干，干燥硅膠保存待用，DNA提取按改良CTAB法進行[11]。

1.2 候選葉綠體SSR位點

21個候選葉綠體SSR位點中有8個（Pt1254、Pt63718、Pt102584、Pt9383、Pt15169、Pt110048、Pt36480、Pt107517） 選 自黑 松 Pinus thunbergii[12]、12個（CJCP1m_002、CJCP1m_003、CJCP1m_004、CJCP1m_007、CJCP2m_001、CJCP2m_002、CJCP2m_006、CJCP2m_007、CJCP2m_008、CJCP2m_009、CJCP2m_010、CJCP3）選自日本柳杉Cryptomeria japonica[13]、1個位點(cp56)的引物根據(jù)臺灣杉Cunninghamia konishii葉綠體非編碼區(qū)序列（Gi:30270556）自行設(shè)計。

1.3 PCR擴增與多態(tài)性分析

首先利用2個樣本材料檢測候選SSR位點能否成功擴增，PCR擴增體系和條件按QIAGEN?多重PCR 試劑盒方法并做適當(dāng)調(diào)整。6.0 μL擴增體系中含1× PCR混合液、0.2 μmol正向和反向引物、5～10 ng的DNA模板。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 預(yù)變性 15 min；94 ℃ 變性 30 s，55 ℃ 退火90 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)；60℃延伸30 min，利用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測候選位點是否有擴增條帶。對于PCR成功擴增的SSR位點，正向引物5' 端以FAM熒光標(biāo)記后用于PCR擴增，擴增方法與前面相同。16個樣本的PCR片段基因分型在ABI3100自動測序儀上進行（Liz 600 為內(nèi)標(biāo)）。GeneScan收集基因分型結(jié)果，基因片段分析用Genotyper3.7軟件。HaplotypeAnalysis1.05軟件用于多態(tài)性位點單倍型分析，估算參數(shù)包括單倍型數(shù)量（A）、有效單倍型數(shù)量（Ne）、單倍型豐富度（Rh）和位點多樣性指數(shù)（H）等。

1.4 多態(tài)性位點的單倍型測序與分析

多態(tài)性位點的PCR擴增結(jié)果直接用于測序分析。測序按BigDye?Terminator v3.1 試劑盒方法 (Applied Biosystems)進行，PCR產(chǎn)物經(jīng)乙醇純化后在ABI3100測序儀上雙向測序（F和R端）。序列經(jīng)Sequencher 4.10軟件剪切、拼接后用MEGA 5.05軟件比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體SSR擴增結(jié)果

21個候選位點中有10個能夠成功擴增，產(chǎn)生了清晰條帶，這10個位點的特征信息見表1。成功擴增位點有7個來自日本柳杉，屬間擴增成功率達(dá)到了58.3%；有2個來自黑松，科間擴增成功率為25.0%。cp56位點來自臺灣杉葉綠體非編碼區(qū)序列，也得到了成功擴增。根據(jù)已有研究結(jié)果，不同物種間擴增成功率與其親緣關(guān)系密切相關(guān)，親緣越近，擴增成功率越高[14-15]。杉木與柳杉是杉科不同屬物種，而與黑松屬不同科物種，來自日本柳杉的SSR位點成功率明顯高于黑松。

2.2 多態(tài)性位點特性

16個杉木樣本基因分型結(jié)果表明，擴增成 功 的10個 位 點 中2個（CJCP1m_004和CJCP2m_002）具有多態(tài)性，均來自于日本柳杉。位點CJCP1m_004檢測到2個單倍型， 核苷酸長度分別為164 bp和165 bp，SSR重復(fù)單元為1 bp（見圖1），與來源物種日本柳杉相同。該位點有效單倍型數(shù)量（Ne）為1.28，多樣性指數(shù)為0.233。位點CJCP2m_002檢測到6個單倍型，核苷酸長度分別為353、354、355、356、357和359 bp（見圖2），其中既有2 bp重復(fù)單元，又出現(xiàn)1 bp重復(fù)單元類型，與來源物種日本柳杉的2 bp重復(fù)單元[(AT)8]并不相同。該位點有效單倍型數(shù)量（Ne）為3.2，多樣性指數(shù)為0.733。

2.3 多態(tài)性位點單倍型變異分析

單倍型測序結(jié)果表明，CjCP1m_004位點的SSR重復(fù)單元為（T）n，與來源物種日本柳杉相同。但CJCP2m_002位點不僅有(AT)n2核苷酸重復(fù)單元，而且還存在(T)n單核苷酸重復(fù)單元（見圖3），與來源物種（日本柳杉）并不相同。CJCP2m_002位點的單倍型測序分析進一步驗證了基因分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。正是由于該位點在杉木葉綠體基因組中存在復(fù)合SSR重復(fù)單元，其單倍型變異則更為豐富。

表1 杉木種間擴增法成功擴增的cp-SSR位點信息?Table 1 Characterization of successful amplification loci of cp-SSR of C. lanceolata

圖1 位點CJCP1m_004 基因分型檢測結(jié)果（2個單倍型，每個單倍型各2個樣本）Fig. 1 Genotyping of locus CJCP1m_004 (showed 2 haplotypes and 2 samples of each haplotype)

3 結(jié)論與討論

傳統(tǒng)微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)以基因文庫構(gòu)建法（包括SSR富集文庫）為主[16-17]，實驗過程復(fù)雜，費時費力，效率較低。微衛(wèi)星標(biāo)記還可以利用種間擴增法[18]進行篩選，該方法基于微衛(wèi)星側(cè)翼序列的保守性，具有經(jīng)濟、高效、快速等特點，是微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)的便捷方式。相對于核基因組而言，葉綠體基因組進化速度慢，保守性更強，很多葉綠體微衛(wèi)星標(biāo)記不僅能在種間有效擴增，而且屬間、甚至不同科物種間也可能具有通用性。裸子植物中，Vendramin 等[6,19]開發(fā)的松Pinus、冷杉Abies葉綠體SSR可在多個科屬物種間擴增，已成為裸子植物葉綠體微衛(wèi)星通用標(biāo)記。本研究選用的黑松葉綠體SSR在杉木中擴增成功率為25.0%，未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點，但來自日本柳杉的SSR位點擴增成功率達(dá)到了58.3%，其中2個位點具有多態(tài)性。建議利用種間擴增法篩選候選標(biāo)記時，應(yīng)充分考慮物種間的親緣關(guān)系，盡量從親緣關(guān)系較近的物種篩選標(biāo)記位點。實驗中還有8個位點未檢測到多態(tài)性，這可能與檢測樣本數(shù)量過少（16個）或樣本間親緣關(guān)系較近有關(guān)，相信隨著杉木樣本數(shù)量的增多或選用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的種質(zhì)，這些位點中可能還會有多態(tài)性位點存在。

圖2 位點CJCP2m_002基因分型檢測結(jié)果（6個單倍型）Fig. 2 Genotyping of locus CJCP2m_002 (showed 6 haplotypes)

圖3 位點CJCP2m_002 的6個單倍型序列比對結(jié)果（SSR部分）Fig. 3 Sequencing alignment results of 6 haplotypes from locus CJCP2m_002 (SSR sequence)

雖然葉綠體基因組保守性強，但不同物種間SSR核心序列變異現(xiàn)象仍較為普遍。這種變異不僅有SSR重復(fù)長度的不同，而且重復(fù)單元（motif）本身也會存在變異[20]，從而引起擴增片段的高度多態(tài)性。Vendramin 等[6]檢測發(fā)現(xiàn)有3個葉綠體SSR位點（Pt15169、Pt48210、Pt87268）在黑松和歐洲白皮松Pinus leucodermis之間存在重復(fù)單元變異，表現(xiàn)為在間隔一定數(shù)量核苷酸序列后，相同重復(fù)單元又會出現(xiàn)。我們在杉木序列分析中發(fā)現(xiàn)CJCP2m_002位點更為特別，該位點不僅存在SSR長度差異，而且同時存在單核苷酸和2核苷酸重復(fù)單元類型，其在杉木葉綠體基因組中呈現(xiàn)高度多態(tài)性，16個檢測樣本中發(fā)現(xiàn)6個單倍型，多樣性指數(shù)達(dá)到了0.733。而在日本柳杉葉綠體基因組中，CJCP2m_002位點是2核苷酸重復(fù)單元類型，僅檢測到2個單倍型[13]，多樣性指數(shù)為0.201，這種現(xiàn)象說明CJCP2m_002在杉木葉綠體基因組中屬于高突變位點。因此，筆者在利用種間擴增法篩選目標(biāo)物種的SSR位點時，應(yīng)仔細(xì)檢查目標(biāo)物種的擴增片段大小，必要時可對目標(biāo)物種的單倍型（等位基因）進行測序分析，以全面掌握SSR核心序列的變異情況。

杉木葉綠體微衛(wèi)星分析中，筆者利用ABI3100測序儀檢測擴增位點的多態(tài)性和單倍型大小，毛細(xì)管電泳技術(shù)高效、靈敏，能準(zhǔn)確分辨1 bp差異的擴增片段。葉綠體微衛(wèi)星標(biāo)記中單核苷酸重復(fù)類型較為普遍，單倍型之間可能僅是幾個堿基，甚至1個堿基的差異，傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨能力有限。因此，在條件允許的情況下，建議利用自動測序儀進行葉綠體微衛(wèi)星基因分型研究，以獲得更為準(zhǔn)確可靠的分析結(jié)果。

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