辛培堯 ，陳 杰 ，唐軍榮 ，田 斌 ，周 軍

（1.西南林業(yè)大學 國家林業(yè)局西南地區(qū)生物多樣性保育重點實驗室，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學 林學院，云南 昆明 650224；3.畢節(jié)市科技局 中藥研究所，貴州 畢節(jié) 551700）

滇楊Populus yunnanensisDode是楊柳科Salicaceae楊屬Populus青楊派（Tacamahaca）樹種，主產于云南、四川和貴州海拔1 300～3 200 m的山地。具有速生、耐寒、成材早，且易于無性繁殖等特點。滇楊為我國西南地區(qū)特有的鄉(xiāng)土樹種，也是全國乃至世界少有的分布于低緯度高海拔地區(qū)的楊樹種質資源。然而，滇楊具有易感染楊樹黑斑病、楊樹潰瘍病、易遭蛀干蟲害且分枝多的弊端，致使其優(yōu)良特性不能得到充分的利用[1-2]。目前，滇楊群體基本以雄株為主，雌株稀缺，遺傳資源相對較少，在一定程度影響著對滇楊不良性狀的遺傳改良。因此，有必要利用現(xiàn)有的遺傳育種手段，創(chuàng)育更多的滇楊種質新材料，對其進行有效的改良，充分利用其生產價值。多倍體育種是有效改良植物種質的方法之一。由于基因劑量的增加，林木多倍體較其二倍體通常表現(xiàn)出營養(yǎng)器官的巨大性，利用多倍體育種常能獲得優(yōu)質、速生、高產及抗性強的林木品種，可大幅縮短用材林等的培育周期，提高單位時間和用地效率[3]。楊樹多倍體育種在我國雖然已取得了較多的成果，但有關滇楊多倍體的誘導研究鮮見報道。試驗利用已有的滇楊組織培養(yǎng)技術[4-6]，以滇楊葉柄為實驗材料，通過預培養(yǎng)后再與秋水素結合進行分化培養(yǎng)的方法，誘導滇楊多倍體種質，以期為滇楊乃至其他木本植物的多倍體育種工作提供理論依據(jù)和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料取自西南林業(yè)大學校園內生長健壯、無病蟲害的一年生滇楊枝條，將枝條剪成50～60 cm長的莖段，摘除全部葉片后置于室內水培，待其長出新葉后剪下葉柄作為外植體。

1.2 方 法

1.2.1 外植體的消毒

外植體的消毒采用辛培堯等[4]提出的方法。

1.2.2 預培養(yǎng)及多倍體誘導

采用辛培堯等[4]提出的方法，將消毒后的外植體首先接入普通分化培養(yǎng)基預培養(yǎng)3～7 d，再分別在附加有30 mg/L和40 mg/L秋水仙素的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)1～3 d，而后轉入未附加秋水仙素的分化培養(yǎng)基上誘導叢生芽，獲取變異植株。實驗設計15種處理方法，并以不進行任何處理的葉柄分化培養(yǎng)情況作為對照，每處理接種30瓶，每瓶接種葉柄4枚。在此過程中觀察性狀變異明顯的芽的數(shù)量，并統(tǒng)計發(fā)芽率和誘導率。實驗設計如表1所示。

表1 30 mg/L和40 mg/L秋水仙素誘導培養(yǎng)方案Table 1 Culture formulas with 30 mg/L and 40 mg/L colchicine

1.2.3 多倍體叢生芽的“同質化”

經誘導后，表觀上具有多倍性的材料大多為“嵌合體”，需進一步對這類材料進行“同質化”處理，以期得到倍性一致，性狀穩(wěn)定的多倍體材料。挑取生長狀況良好，表觀上多倍化性狀突出的材料（表現(xiàn)為葉片變大變厚，莖段變粗變短）的莖段，剪為0.5～1.0 cm的小段，平鋪于分化培養(yǎng)基上[4]，稍做按壓，讓莖段與培養(yǎng)基充分接觸即可。待重新分化出的叢生芽長勢比較一致且能夠很好地觀察叢生芽性狀時，繼續(xù)挑選多倍化性狀良好的叢生芽，再次重復培養(yǎng)，直到新長出的叢生芽性狀一致并穩(wěn)定。

1.2.4 增殖培養(yǎng)

切取上述性狀穩(wěn)定的叢生芽，接種在增殖培養(yǎng)基[5]上進行增殖。

1.2.5 生根培養(yǎng)

經試驗，采用辛培堯等[5]提出的二倍體滇楊試管苗生根培養(yǎng)方案，對多倍化的滇楊材料進行生根培養(yǎng)并不能獲得理想的效果。試驗以1/2MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的NAA和IBA，pH值為5.8～6.2。試驗共計16個處理，每個處理接種10瓶，每瓶5棵試管苗。試驗設計方案見表2。

表2 滇楊多倍化材料生根培養(yǎng)方案Table 2 Rooting culture formulas of polyploid P. yunnanensis

1.2.6 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)條件均為溫度（25±2）℃、光照1 500～2 000 lx、光照時間14 h/d、相對濕度70%～80%。不定期用70%酒精噴霧殺菌降塵并定期用甲醛和高錳酸鉀對實驗室及培養(yǎng)室進行密閉熏蒸殺菌。

1.2.7 根尖染色體觀察

采用常規(guī)制片法壓片[7]，選取同質化處理后多倍化性狀明顯且穩(wěn)定、一致的滇楊組培生根苗，截取其根尖進行染色體數(shù)目的觀察，以確定其倍性，同時以其相應的二倍體材料為對照。

2 結果與分析

2.1 秋水仙素誘導滇楊多倍體

消毒后的滇楊葉柄分別進行3～7 d預培養(yǎng)后，再轉移至添加秋水仙素的培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)。在接入外植體的25 d前，具有明顯多倍體特征的叢生芽較少，25 d以后，目標芽數(shù)量逐漸增多，可以觀察到葉片變大變厚、部分葉片卷曲、葉緣鋸齒變大、莖段變粗。觀察發(fā)現(xiàn)，在這一過程中，隨著時間的推移，芽分化的速度由慢變快，最后再趨于平緩。在附加有秋水仙素的培養(yǎng)基中，芽的誘導分化率明顯低于對照，這也說明了秋水仙素對植物的毒害效果是比較明顯的。當試管苗分化到第35 d時，不再出現(xiàn)明顯的芽分化。統(tǒng)計數(shù)據(jù)并作方差分析（見表3）。

表3顯示，以30 mg/L秋水仙素為處理濃度時，不同的預培養(yǎng)時間，外植體在發(fā)芽率上存在顯著差異，CK在發(fā)芽率上保持了最高水平，為78.14%，由于其未附加秋水仙素，對材料沒有造成任何的毒害作用。在附加秋水仙素的處理組合中，3-1僅次于CK，發(fā)芽率為36.65%，其次為3-2和3-3（發(fā)芽率分別為35.25%和35.10%）；處理7-2和7-3發(fā)芽率較低，分別為30.30%和30.88%。叢生芽的變異率在不同的處理間也存在顯著差異。處理7-2變異率最高，達到了37.16%；其次為7-1和7-3變異比率均超過了30%，分別為30.23%和32.20%；處理3-1的變異率最低（僅為7.5%），而CK的變異率為0。由表3不難看出，隨著預培養(yǎng)天數(shù)的增加，變異率有逐漸提高的趨勢。在誘導處理時間方面，處理2 d的組合其變異比率相對高于處理1 d和3 d的組合。由此認為，在附加30%秋水仙素的培養(yǎng)基中處理材料時，2 d的處理效果優(yōu)于1 d和3 d。綜合誘導發(fā)芽率和誘變率可以看出，在30%秋水仙素的處理下，預培養(yǎng)7 d再誘導處理2 d，可以獲得較好的誘導效果，此明的發(fā)芽率為30.30%，誘變率為37.16%。

以40 mg/L為秋水仙素處理濃度時，處理3-1和3-2發(fā)芽率較高（為33.08%和32.83%，兩者之間無顯著差異；發(fā)芽率最低的處理為6-2，其發(fā)芽率僅為28.83%。隨著預處理時間的延長，外植體的發(fā)芽率呈下降趨勢（表3）。表3還表明，附加40 mg/L秋水仙素進行誘導時，不同的處理對滇楊變異率的影響同樣存在顯著差異；變異率最低時為10.90%（處理3-1），最高時為50.96%（處理5-2）。從材料在附加秋水仙素的培養(yǎng)基中誘導處理不同時間的效果來看，處理2 d的所有組合其變異率均高于處理1 d和3 d的。同樣認為在附加40%秋水仙素的培養(yǎng)基中處理滇楊葉柄時，2 d的秋水仙素誘導處理效果優(yōu)于1 d和3 d的。綜合誘導后的發(fā)芽率和誘變率可以發(fā)現(xiàn)，預培養(yǎng)5 d，再在40%秋水仙素下誘導處理2 d，其誘導效果（發(fā)芽率為29.90%，誘變率為50.96%）優(yōu)于預培養(yǎng)7 d再在30%秋水仙素下誘導處理2 d的效果。因此，認為，滇楊葉柄在未附加有秋水仙素的分化培養(yǎng)基上預培養(yǎng)5 d，再在附加有40%秋水仙素的分化培養(yǎng)基上誘導處理2天，是其多倍體誘導的較佳條件。

表3 滇楊多倍體誘導結果?Table 3 Polyploid induction results of P. yunnanensis

2.2 多倍體叢生芽同質化培養(yǎng)

在同質化培養(yǎng)的前5次中，具有多倍化性狀的組培苗個體之間生長差異較大，常表現(xiàn)為同一個莖段或葉片上分化出來的叢生芽，粗細不一，芽高差異較大，葉片大小及葉卷曲不一；部分芽顏色差別明顯，常表現(xiàn)為粗壯的芽葉色墨綠，長勢相對較細的芽葉色呈黃綠色。第6次培養(yǎng)時，葉片大小及莖段粗細差異逐漸趨同，多倍體芽數(shù)迅速增多，但仍存有部分差異過大的芽。對目標性狀相當明顯的叢生芽繼續(xù)重復分化培養(yǎng)到第8次，其多倍化性狀即可穩(wěn)定，并表現(xiàn)一致（見圖1）。

圖1 多倍化性狀穩(wěn)定的滇楊叢生芽Fig.1 Clustered shoots with stable polyploidy characters of P. yunnanensis

2.3 生根培養(yǎng)試驗

對具有多倍性的增殖苗進行生根培養(yǎng)。生根培養(yǎng)過程中的生根率、平均生根數(shù)以及苗的生長情況列于表4。

由表4可以看出，滇楊多倍化試管苗在不同濃度組合的IBA和NAA生根培養(yǎng)基上，其生根率差異顯著。生根率最高的培養(yǎng)組合為11及14（生根率為90%），且均與其他組合有顯著差異；組合3、7、10、12、15和16之間無顯著差異，生根率均為85%，生根率最低的為組合1，其生根率僅達到50%。多倍化植株平均生根數(shù)間差異顯著，生根數(shù)量最多的培養(yǎng)條件為組合11，其平均根數(shù)達到了6.6條。表現(xiàn)為生根數(shù)量多，且根毛也較多等性狀。組合15（平均生根數(shù)量為6.3條）與11（平均生根數(shù)量為6.6條）雖然在生根數(shù)上無顯著差異，但其生根率僅為85%，低于組合11（為90%），且生根后根毛較少。組合14雖生根率較高，但其平均生根數(shù)僅為4.6條。平均生根數(shù)最低的為組合1（僅為0.6條）。

表4 滇楊多倍體生根培養(yǎng)結果Table 4 Rooting culture results of polyploid P. yunnanensis

綜上，生根培養(yǎng)條件組合11（MS+IBA0.10 mg/L+NAA0.10 mg/L）中，滇楊多倍化組培苗有較高的生根率及生根數(shù)，根毛較多，且幼苗生長健康，葉色墨綠，因此認為，該培養(yǎng)條件為滇楊多倍化材料誘導生根的較佳培養(yǎng)方案。

圖2 多倍化滇楊生根情況Fig.2 Rooting complexion of polyploidy P. yunnanensis

2.5 滇楊多倍化材料染色體數(shù)目的觀察

選取了10株性狀變異明顯的滇楊多倍化材料進行染色體數(shù)目觀察，并以二倍體材料為對照。結果表明，滇楊二倍體材料染色體數(shù)目為2n=2X=38（見圖3）；4株多倍化材料葉片近似圓形，染色體數(shù)目為2n=4X=76，可以判斷其為滇楊四倍體（見圖4）；另6株材料為較二倍體明顯變大變厚的菱形葉，且在同一根尖中發(fā)現(xiàn)了38條和76條染色體兩種細胞，初步判定其仍然為嵌合體。

圖3 滇楊二倍體細胞（2n=2X=38）Fig.3 Diploid cells of P.yunnanensis (2n=2X=38)

圖4 滇楊四倍體細胞（2n=4X=76）Fig.4 Tetraploid cells of P.yunnanensis (2n=4X=76)

3 結論與討論

（1）目前，利用秋水仙素誘導多倍體是林木多倍體誘導中最常用的方法，誘導過程中常利用秋水仙素溶液處理種子及生長點等，從而得到倍性變化的植株。隨著組織培養(yǎng)技術的成熟，利用秋水仙素結合組織培養(yǎng)技術誘導多倍體逐漸被廣泛的應用，該技術在林木多倍體育種方面已經有了較多的嘗試[8-14]。陳杰等[15]將滇楊葉柄首先直接在附加有10種不同秋水仙素濃度的分化培養(yǎng)基上分別培養(yǎng)10～20 d，然后再轉接入未附加有秋水仙素的分化培養(yǎng)基上進行誘導。在80～90 mg/L的秋水仙素下，分別處理20～30 d，處理效果較好，但變異誘導率只達到16.18%。本研究首先是對葉柄進行3～7 d的預培養(yǎng)，然后進行多倍體的誘導培養(yǎng)，取得的更好的效果，變異誘異率高達50.96%。蔣巖峰[16]，李政等[17]分別在誘導南林895楊（Populus×euramericanacv.‘Nanlin895’）和綠玉樹多倍體時，均發(fā)現(xiàn)進行一定時間的預培養(yǎng)，較直接分化誘導培養(yǎng)，可明顯提高后期的變異誘導率。這與本研究的結果相一致。預培養(yǎng)使得外植體的細胞發(fā)生一定程度分裂活動或者處于分裂旺盛時期，在此時期誘導分化，更利于得到加倍的細胞或細胞團，從而獲得更多的誘變組織，提高誘變率。

（2）陳杰等[15]的研究發(fā)現(xiàn)滇楊多倍體植株在二倍體植株的生根培養(yǎng)基上生根效果不佳。對不同倍性的刺槐生根培養(yǎng)時也發(fā)現(xiàn)了這個問題[18-19]。本試驗設計了16種多倍化滇楊生根培養(yǎng)條件，最終發(fā)現(xiàn)，MS+IBA0.10 mg/L+NAA0.10 mg/L的條件下，滇楊多倍化組培苗的生長和生根效果最佳。

（3）齊力旺等[20-22]以我國楊屬青楊派的9個代表性種為材料，對其染色體核型進行分析后認為，青楊派的核型較為穩(wěn)定，其染色體數(shù)目均為38，未發(fā)現(xiàn)天然多倍體。滇楊屬于青楊派樹種，試驗對二倍體滇楊染色體數(shù)目觀察的結果為38，同時誘導獲得了染色體數(shù)目為76的滇楊四倍體材料。另外，還發(fā)現(xiàn)有部分植株在同一根尖中同時存在染色體數(shù)目為38和76的細胞，對于這類材料，有待于進一步的同質化處理，以獲得純合的滇楊多倍體種質。

[1] 何承忠,張志毅,陳寶昆,等.滇楊遺傳改良策略初論[J].西部林業(yè)科學,2004,33(1):44-48.

[2] 何承忠,車鵬燕,周修濤,等.滇楊基因資源及其研究概況[J].西南林學院學報,2010,30(1):83-88,94.

[3] 康向陽,王 君.楊樹多倍體誘導技術研究[M].北京:科學出版社,2010.

[4] 辛培堯,劉 巖,段安安,等.滇楊不同外植體分化培養(yǎng)研究[J].云南農業(yè)大學學報:自然科學版,2011,26(6):828-832,860.

[5] 辛培堯,劉 巖,孫正海,等.滇楊的增殖及生根培養(yǎng)研究[J].湖北農業(yè)科學,2012,51(15):3366-3369.

[6] 辛培堯,劉 巖,李根前,等.滇楊組培苗移栽技術研究[J].中南林業(yè)科技大學學報,2012,32(2):23-26.

[7] 李懋學,張贊平.作物染色體及研究技術[M].北京:中國農業(yè)出版社,1996.

[8] 尚宗燕,張繼祖.漆樹染色體觀察及三倍體漆樹的發(fā)現(xiàn)[J].西北植物學報1985,5(3):l87-191.

[9] 孫仲序,李云榮.刺槐同源多倍體誘導初報[J].山東林業(yè)科技,1984(2) :12-23.

[10] 王俠劍.桑樹多倍體植株育成初報[J].蠶業(yè)科學,1981,7(2):83-86.

[11] 王長泉,張文勝.蘋果葉片離體培養(yǎng)中秋水仙素加倍效應的研究[J].果樹科學,1999,16(2):104-109.

[12] 楊今后,楊新華,駱承軍.桑樹多倍體及其育種研究進展[J].蠶業(yè)科學,1992,18(2):195-201.

13] 曾憲松,張樹珍,張銀東,等.離體培養(yǎng)橡膠樹體細胞誘導純多倍體無性系方法的研究初報[J].熱帶作物學報,1997,18(2):15-19.

[14] 祝澤兵.山楊和小黑楊多倍體誘導及生長與光合特性分析[D].哈爾濱:東北林業(yè)大學,2010.

[15] 陳 杰,周 軍,孫正海,等.組織培養(yǎng)結合秋水仙素誘導滇楊多倍體的研究[J].云南農業(yè)大學學報:自然科學版,2013,28(2): 251-256.

[16] 蔣巖峰.楊樹染色體加倍技術研究[D].南京:南京林業(yè)大學,2008.

[17] 李 政,黃靜潔,李 凌.秋水仙堿誘變綠玉樹多倍體研究[J].西南大學學報:自然科學版,2007,29(2):106-110.

[18] 高艷明,李建設,高 娜,等.刺槐組織培養(yǎng)繁殖技術[J].林業(yè)科技,2005,30(1):9-10.

[19] 劉丹梅,衣 杰,孫書偉.四倍體刺槐組培瓶苗生根培養(yǎng)研究[J].遼東學院學報,2007,14(2):70-72.

[20] 齊力旺,張守攻,韓素英,等. 楊屬青楊組種（品種）間核型比較[J].云南植物研究,2004,26(5):537-542.

[21] 梁楠松,周 姍,李蕾蕾,等.小黑楊bHLH轉錄因子基因和啟動子的克隆與分析[J].經濟林研究,2013,31(4): 58-66.

[22] 王玉霞,李林光,王海波,等.三倍體蘋果雜交后代及其親本果實香氣及品質分析[J].經濟林研究,2013,31(4): 82-86,97.