吳媛媛 汪 煥 張 瑞 趙 帥 劉雯婷 張盛周

（安徽師范大學生命科學學院生物環(huán)境與生態(tài)安全省級重點實驗室，蕪湖241000）

中華蟾蜍（Bufo gargarizans）隸屬兩棲綱無尾目蟾蜍科，在我國分布廣泛，屬兩棲類的優(yōu)勢種群，捕食害蟲，蟾酥和蟾衣可入藥，具有重要的生態(tài)價值和經(jīng)濟價值［1，2］，也是重要的科研和教學用實驗動物。中華蟾蜍人工養(yǎng)殖已引起廣泛重視，目前對其一般生物學和藥用價值方面的研究較多，但有關(guān)其消化機能方面的研究尚少［3，4］。本文對中華蟾蜍消化道粘膜酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（ALP）、腺苷三磷酸酶（ATPase）、過氧化物酶（POX）、非特異性酯酶（NSE）和琥珀酸脫氫酶（SDH）等6種酶的活性進行了研究，旨在增進對其消化機能的認識，為其人工養(yǎng)殖提供基礎(chǔ)資料。

材料和方法

1.材料

成體中華蟾蜍6只，購自蕪湖水產(chǎn)市場，重200－250 g，穿刺毀股，立即解剖，取出整個消化道，用生理鹽水洗凈，按下列部位取材：食道，胃賁門，胃體，胃幽門，十二指腸，空腸，回腸和直腸。一組放置在－80℃冰箱中，利用冰凍切片技術(shù)對其進行切片，切片厚度為6μm；另一組于Carnoy氏液固定4h，常規(guī)石蠟包埋，并對其進行切片，切片厚度為6μm。

2.酶組織化學方法

酶的組織化學方法參照宋華［5］的方法進行滴染，略有改動。

2.1 ACP

用Carnoy氏液固定的石蠟切片，采用鉛法顯示。ACP作用試液為：0.1 mol／L醋酸緩沖液（p H 5.2）和0.24%硝酸鉛溶液，3%β－甘油磷酸鈉。35℃條件下，把做好的切片放入孵育液中25 min；蒸餾水滴洗2×2 min；再入1.5%硫化氨溶液2 min；蒸餾水滴洗2 min；無蘇木精復染?；钚圆课怀勺攸S色沉淀。

2.2 ALP

采用NBT／BCIP法顯示。ALP作用液為：堿性磷酸酶緩沖液（p H 9.2）；5%硝基藍四唑（NBT）和5%5－溴－4－氯－3－吲哚－磷酸鹽（BCIP）混合后在20 min內(nèi)使用；把做好的冰凍切片放入作用液中20 min；蒸餾水滴洗2×3 min；無蘇木精復染?；钚圆课怀伤{紫色沉淀。

2.3 ATPase

采用鈣－鈷法顯示。ATPase作用液為：腺苷三磷酸二鈉鹽（ATP鈉鹽）溶于蒸餾水然后用2 mol／L NaOH調(diào)p H至9.2，2%巴比妥鈉溶液，2%無水CaCl2溶液，蒸餾水和2，4－二硝基苯酚混合液混勻后用2 mol／L NaOH溶液調(diào)p H至9.0；把做好的冰凍切片先放入1%CaCl2溶液中5 min；然后滴加上述過濾后的作用液放置35℃，50 min；蒸餾水2×2 min，入2%硝酸鉛溶液內(nèi)5 min；蒸餾水2×2 min，入4%中性甲醛溶液中固定2 min；蒸餾水滴洗2 min，入2%硫化氨溶液中2 min；蒸餾水滴洗2×3 min；無蘇木精復染。活性部位成棕黑色沉淀。

2.4 NSE

采用偶氮法顯示。NSE作用液為：α－乙酸萘脂，丙酮，0.1 mol／L PBS（p H 7.4）和六偶氮對品紅混合后用2 mol／L NaOH溶液調(diào)p H至5.8，此溶液在20 min內(nèi)使用；把做好的冰凍切片放入作用液中15 min；蒸餾水滴洗2×3 min；無蘇木精復染?；钚圆课怀勺丶t色沉淀。

2.5 POX

采用DAB法顯示。POX作用液為：3，3－二氨基聯(lián)苯胺（DAB），0.1 mol／L Tris－HCl緩沖液（p H7.6）和0.2%H2O2混合液混合后調(diào)p H至7.6；把做好的冰凍切片放入作用液中25 min；蒸餾水滴洗2×3 min；無蘇木精復染?；钚圆课怀勺攸S色沉淀。

2.6 SDH

采用四唑鹽法顯示。SDH作用液為：0.4%硝基藍四唑（NBT），0.1 mol／LPBS（p H7.4）和0.2 mol／L琥珀酸鈉鹽混合液混勻后滴加在事先做好的冰凍切片上，室溫顯示45 min；蒸餾水滴洗2×3 min；無蘇木精復染?；钚圆课怀伤{紫色沉淀。

3.光密度測定與數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Olympus BX61型顯微鏡，在400倍視野下拍照。采用Image－Pro Plus圖像分析軟件，對酶組織化學染色陽性部位進行光密度分析，測出切片中陽性部位的累計光密度（integrated optical density，IOD）和面積（area），算出平均光密度（mean optical density，MOD）。陽性部位染色越深，平均光密度值越大，以平均光密度值表示消化道各部位酶活性的強弱，采用單因素方差分析（one－way ANOVA）對各種酶的活性變化進行差異顯著性比較，P＜0.05為差異顯著。

結(jié) 果

酶的組織化學染色顯示6種酶在中華蟾蜍消化道中均有分布，且經(jīng)光密度分析后，6種酶在消化道各段的活性存在一定的差異（表1）。

表1 中華蟾蜍消化道6種酶的分布Table 1 Distribution of six types of enzymes in the digestive tract of Bufo gargarizans

1.酸性磷酸酶（ACP）

ACP活性部位顯示棕黃色硫化鉛沉淀（圖1，2）。ACP分布于除直腸外的整個消化道中，在胃賁門部酶活性最高，十二指腸和回腸酶活性較低（P＜0.05）。ACP在胃賁門部主要分布在胃賁門腺中，在上皮細胞中也有少量分布。在十二指腸和回腸中分布相似，酶活性均自粘膜上皮基底至紋狀緣處逐漸增高，并在上皮細胞內(nèi)呈顆粒狀分布。

2.堿性磷酸酶（ALP）

ALP活性部位顯示藍紫色沉淀（圖3）。ALP在整個消化道中均有分布，在十二指腸和空腸處酶活性最高，食管、胃幽門和胃體次之，胃賁門處酶活性顯著較低（P＜0.05）。酶活性主要分布在消化道粘膜上皮，十二指腸和空腸酶活性主要分布在紋狀緣處，而胃賁門中胃腺部酶活性顯著高于粘膜上皮層。

3.腺苷三磷酸酶（ATPase）

ATPase活性部位成棕黑色（圖4，5，6）。ATPase在消化道各段均有分布，以胃體和回腸酶活性顯著較高（P＜0.05），直腸其次，十二指腸、空腸、食管和胃幽門次之，胃賁門處酶活性顯著較低（P＜0.05）。ATPase酶活性主要分布在胃腺及消化道粘膜上皮中，胃腺中酶活性顯著高于粘膜上皮層，腸道中酶活性自粘膜上皮至紋狀緣處顯著提高。

4.非特異性酯酶（NSE）

NSE活性部位顯示棕紅色沉淀（圖7，8）。NSE在消化道各段均有分布，以空腸、食管和胃幽門酶活性顯著較高，回腸和直腸其次，十二指腸和胃體較低，胃賁門酶活性最低（P＜0.05）。酯酶在消化道粘膜上皮中分布較多，在固有層也有分布，但主要還是分布在胃腺及賁門腺中，在食管中主要分布在上皮基底及近游離處。

5.過氧化物酶（POX）

POX活性部位顯示黃棕色（圖9，10）。POX在消化道各段均有分布，在空腸和胃賁門酶活性顯著較高（P＜0.05），胃體、十二指腸和直腸其次，回腸酶活性顯著較低（P＜0.05）。過氧化物酶在消化道粘膜上皮和固有層中均有分布，在胃賁門腺及胃腺中也有大量分布，且呈棕黃色顆粒狀分布。

6.琥珀酸脫氫酶（SDH）

SDH活性部位成藍紫色（圖11，12）。SDH在消化道各段均有分布，以十二指腸和回腸中酶活性最高，胃體和胃幽門處其次，在胃賁門和空腸次之，食管和直腸最低（P＜0.05）。腸道中酶活性主要分布于紋狀緣，在上皮基底未檢測到酶活性，胃中胃腺酶活性顯著高于粘膜上皮層。

圖1 胃賁門酸性磷酸酶；圖2回腸酸性磷酸酶；圖3十二指腸堿性磷酸酶；圖4胃體腺苷三磷酸酶；圖5十二指腸腺苷三磷酸酶；圖6直腸腺苷三磷酸酶；圖7胃體非特異性酯酶；圖8空腸非特異性酯酶；圖9胃幽門過氧化物酶；圖10空腸過氧化物酶；圖11胃幽門琥珀酸脫氫酶；圖12回腸琥珀酸脫氫酶。L：消化道腔；LP：固有層；CG：賁門腺；FG：胃底腺；PG：幽門腺；ME：黏膜上皮；SB：紋狀緣；標尺：50μmFig.1 ACP in the stomachus cardiacus；Fig.2 ACP in the ileum；Fig.3 ALP in the duodenum；Fig.4 ATPase in the stomachus corpus；Fig.5 ATPase in the duodenum；Fig.6 ATPase in the rectum；Fig.7 NSE in the stomachus corpus；Fig.8 NSE in the jejunum；Fig.9 POX in the stomachus pyloricus；Fig.10 POX in the duodenum；Fig.11 SDH in the stomachus pyloricus；Fig.12 SDH in the ileum.L：lumen of the digestive tract；LP：lamina propria；CG：cardiac gland；FG：fundic gland；PG：pyloric gland；ME：mucosal epithelia；SB：striated border；Scale bar：50μm

討 論

酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（ALP）普遍存在于動物的各組織中，是機體生長與發(fā)育、保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和維持機體健康所必須的酶。ACP是細胞溶酶體的一種標志酶，也是參與細胞內(nèi)消化的重要水解酶，ACP活性越高，表明該部位胞飲作用和細胞內(nèi)消化功能越活躍［6，7］。本研究顯示中華蟾蜍ACP主要分布于胃賁門、十二指腸及回腸中，與牛蛙（Rana catesbeinana）［8］主要分布于胃部，黑眉錦蛇（Elaphe taeniura）［5］主要分布于十二指腸及空腸均不同，種間差異較明顯。ALP參與脂類、葡萄糖、鈣和無機磷酸鹽等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，一般把ALP作為營養(yǎng)物質(zhì)吸收的標志酶［7，9］。尼羅非洲鯽魚（Oreochromis niloticus）［10］和牛蛙［8］主要分布在腸道，本研究顯示中華蟾蜍ALP主要分布于十二指腸和空腸，在其它部位也均有分布，與牛蛙ALP的分布基本一致。中華蟾蜍消化道ACP和ALP的分布表明中華蟾蜍胃和小腸黏膜均具有較強的細胞內(nèi)消化功能，十二指腸和空腸是主要吸收部位。

腺苷三磷酸酶（ATPase）是位于細胞膜上的一種糖蛋白，主要參與維持細胞膜內(nèi)外的離子梯度差，以及腸上皮細胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收［11］。牛蛙ATPase在消化道各段均有分布［8］，黑眉錦蛇除直腸外均有分布［5］，中華蟾蜍ATPase在胃體和回腸處酶活性較高。ATPase在胃中主要位于胃腺，可能與胃腺壁細胞分泌胃酸消化蛋白質(zhì)和分泌粘蛋白促進食物吸收有關(guān)，回腸中則在紋狀緣處酶活性較高，是消化吸收的主要部位。

非特異性酯酶（NSE）對于脂類代謝和生物膜的結(jié)構(gòu)與功能具有一定作用，除了維持細胞正常的能量代謝外，還能水解大量非生理存在的脂類化合物［12］。尼羅非洲鯽魚［10］主要分布在腸道，商城肥鯢（Pachyhynobius shangchengensis）［13］主 要 在 胃 體和腸，歐洲無須鱈（Merluccius merluccius）［7］和黑眉錦蛇［5］在消化道各段均有分布。本研究發(fā)現(xiàn)中華蟾蜍NSE在消化道各段均有分布，胃和腸道的粘膜上皮細胞及胃腺細胞活性較高，與牛蛙類似，顯示兩棲動物的腸道是脂類消化的主要部位。

過氧化物酶（POX）是一種生物氧化中的末端氧化酶，能夠分解生物體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物，并且利用H2O2氧化酚類及胺類等有毒代謝產(chǎn)物，對機體有雙重保護作用［14］。本研究顯示中華蟾蜍POX酶活性除在空腸和胃賁門較高外，其它部位均顯著較低，這與黑眉錦蛇［5］在直腸酶活性最高，商城肥鯢［12］在胃和腸活性較弱明顯不同。POX在中華蟾蜍消化道各段均有分布，在胃和腸道分布較多，可能與這些部位代謝旺盛、產(chǎn)生較多毒性物質(zhì)有關(guān)。

琥珀酸脫氫酶（SDH）屬于膜結(jié)合酶，是脫氫酶中最重要的酶，是參與三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，其活性一般可以作為評價三羧酸循環(huán)運行程度的指標［15］。SDH在中華蟾蜍整個消化道均有分布，但主要分布在十二指腸和回腸處，可能與接受胃液、胰液和膽汁有關(guān)，是小腸消化吸收的重要部位，與黑眉錦蛇［5］分布在胃部有差異，體現(xiàn)了種間特異性。

總之，中華蟾蜍消化道粘膜6種酶的分布同其它動物有相似之處，亦有其自身特點。不同酶的分布和消化道各部位的生理機能密切相關(guān)。胃體、十二指腸、空腸和回腸是中華蟾蜍的主要消化吸收部位。

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