張麗霞 胡有長(zhǎng) 施橋發(fā) 王美珍 曾文興 江麗霞 王福財(cái) 劉玉琳

（1南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫教研室，江西330006；2嘉興市婦幼保健院婦科，浙江314050；3南昌大學(xué)校醫(yī)院，江西330006；4贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西341000）

子宮頸癌是多基因改變，多步驟發(fā)生的一類全身性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。近年來，研究發(fā)現(xiàn)在微缺氧微環(huán)境下，缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxiainducible factor，HIF）的表達(dá)，對(duì)腫瘤順利完成局部微血管生成、以保障腫瘤快速增殖的營(yíng)養(yǎng)需求至關(guān)重要。HIF是BHLH－PAS超家族成員，是由結(jié)構(gòu)同源的α亞基和共同的β亞基組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子。HIF的α亞基包括1α、2α和3α三個(gè)成員，其中缺氧誘導(dǎo)因子2α（HIF－2α）是1997年由 Tian等克隆發(fā)現(xiàn)的一種含有BHLH－PAS域的細(xì)胞因子，在血管生長(zhǎng)、骨髓造血、能量代謝、腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［1］。本研究應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法及免疫組織化學(xué)法（Elivision法）檢測(cè)宮頸鱗癌組織和正常宮頸組織中HIF－2α、VEGF基因與蛋白的表達(dá)情況，探討其在宮頸鱗癌中的表達(dá)及臨床意義。

材料和方法

1.材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與臨床資料收集

收集江西省婦幼保健院腫瘤科2011年01月至2011年08月經(jīng)病理學(xué)檢測(cè)證實(shí)的子宮頸鱗癌64例為子宮頸癌組，年齡38－70歲，平均51.3±9.2歲。按照宮頸癌2009年International Federation of Gynecology and Obstetrics（FIGO）分期，Ⅰ期30例，Ⅱ期24例，Ⅲ－Ⅳ期10例。選取正常宮頸組織22例作為正常對(duì)照組，年齡32－60歲，平均48.2±8.7歲。所有患者切取組織標(biāo)本前均未接受化療或放療，既往無其他惡性腫瘤病史。

1.2 試劑

DNA Marker DL2000、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime－ScriptTMreagent kit購(gòu)自大連Ta KaRa公司，熒光染料SYBR Green real time PCR master mix－plus為日本 TOYOBO公司生產(chǎn)，2×Taq Plus PCR Master Mix購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，引物由TakaRa公司合成。鼠抗人HIF－2α抗體、鼠抗人VEGF抗體為英國(guó)abcam公司生產(chǎn)，PBS、檸檬酸鹽緩沖液、3%過氧化氫、Polymer helper、Polymer HRP Goat anti－Mouse／Rabbit IgG、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，中性樹膠為上海華申康復(fù)器材有限公司生產(chǎn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

Anke TDL80－2B低溫高速離心機(jī)為美國(guó)Thermo公司生產(chǎn)，紫外分光光度儀為島津－GL消耗品銷售公司，微量加樣器產(chǎn)自德國(guó)Eppendorf公司，7500 Real time PCR儀為美國(guó)Applied Biosystems公司產(chǎn)品，PCR擴(kuò)增儀為新加坡Perkin Elmer公司產(chǎn)品，組織蠟切片機(jī)由德國(guó)Leica公司產(chǎn)生，光學(xué)顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

2.方法

2.1 總RNA提取

在超凈臺(tái)中取50－100 mg組織，迅速放入盛有1 ml Trizol的玻璃研磨器皿中，在冰上進(jìn)行組織勻漿，研磨，至裂解液呈透明狀。將勻漿液（裂解液）轉(zhuǎn)至1.5 ml的EP管中，室溫下靜置5 min。加入0.2 ml氯仿后，蓋緊EP管，反復(fù)振搖15 s，靜置3 min。12000 g、4℃條件下離心15 min。吸取上層水相至另一干凈的EP管，按1 ml TRIZOL／0.5 ml異丙醇的比例加入異丙醇約0.5 m1，充分混勻后，室溫靜置10 min。12000 g、4℃低溫離心10 min，小心棄上清，加入1 ml無Rnase的75%乙醇洗滌，渦旋數(shù)秒后混勻，待充分溶解后，7500 g、4℃，低溫離心5 min。棄上清，室溫自然晾干5 min。加入35μl（30－50μl）DEPC水充分溶解RNA沉淀。將提取的RNA樣品置－80℃冰箱保存，同時(shí)取少量鑒定進(jìn)行紫外分光光度計(jì)鑒定RNA樣品純度和濃度。

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè) HIF－2α、VEGF mRNA表達(dá)

新鮮宮頸標(biāo)本離體后，立即切取組織塊裝入無菌去RNA酶的EP管，轉(zhuǎn)存入－80℃冰箱內(nèi)保存。采用Primer軟件設(shè)計(jì) HIF－2α、VEGF和β－actin上下游引物，具 體 序 列 如 下，HIF－2α：上 游 5′－CATGCGCTAGACTCCGAGAACA－3′；下游5′－GCTTTGCGAGCATCCGGTA－3′，擴(kuò) 增 片 段 長(zhǎng) 度 為 94bp。VEGF：上游：5′－GAGCCTTGCCTTGCTGCTCTA－3′，下游：5＇－CACCAGGGTCTCGATTGGATG－3′，擴(kuò)增片段148 bp；β－actin：上游5′－TGGCACCCAGCACAATGAA－3′； 下 游 5′ － CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA－3′，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為186 bp。以總RNA為模板，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，于37℃15min、85℃5 s合成cDNA。再進(jìn)行PCR擴(kuò)增及SYBRR Premix Ex Taq實(shí)時(shí)熒光定量分析，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30 s、95℃變性5 s、60℃延伸34 s，讀板，40個(gè)循環(huán)。具體操作均按相應(yīng)說明書進(jìn)行。每次擴(kuò)增均設(shè)內(nèi)參基因組和目的基因組以及空白對(duì)照組。通過對(duì)每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)（即ct值），按指數(shù)擴(kuò)增的規(guī)律（2－△△CT）計(jì)算出組織中 HIF－2α、VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2.3 免疫組織化學(xué)Elivision法檢測(cè) HIF－2α、VEGF蛋白表達(dá)

新鮮標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋。每例蠟塊分別連續(xù)切4μm厚切片3張，分別作HE染色和免疫組化染色。用已知陽性的胎盤組織標(biāo)本作VEGF陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。經(jīng)脫蠟、脫水及水化后，相繼滴加一抗、二抗、鏈霉素蛋白－過氧化物酶溶液及二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液，顯微鏡下觀察3－5 min，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。結(jié)果判斷：陽性物質(zhì)為棕黃色顆粒，定位于胞漿，部分在胞核或包膜。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞≤5%（－）；陽性細(xì)胞5%－25%（＋）；陽性細(xì)胞26%－50%（＋＋）；陽性細(xì)胞＞50%（＋＋＋）。結(jié)果采用雙盲的方法，并由江西省婦幼保健院病理科有經(jīng)驗(yàn)的病理學(xué)醫(yī)師通過光學(xué)顯微鏡閱片并攝片。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，對(duì) HIF－2α、VEGF基因mRNA相對(duì)表達(dá)量等計(jì)量資料采用 表示，采用成組設(shè)計(jì)的t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。HIF－2α、VEGF基因m RNA表達(dá)相關(guān)性用pearson相關(guān)性檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對(duì)HIF－2α、VEGF蛋白在組織中的表達(dá)等級(jí)分類資料，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性統(tǒng)計(jì)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

結(jié) 果

1.宮頸鱗癌、正常宮頸組織中 HIF－2α、VEGF mRNA的表達(dá)及其相關(guān)性分析

經(jīng)SYBRR Premix Ex Taq實(shí)時(shí)熒光定量分析，子宮頸鱗癌組中 HIF－2αmRNA及VEGF mRNA表達(dá)水平分別為1.3418±0.812和4.4543±2.585，顯著高于正常宮頸組的0.1375±0.087和0.9127±0.382（P＜0.01，見表1、表2）。

經(jīng)pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析結(jié)果表明，子宮頸癌組HIF－2α與VEGF m RNA表達(dá)存在顯著相關(guān)（R＝0.778，P＜0.001，見表2，圖2）。

表1 HIF－2α與VEGF m RNA在宮頸鱗癌及正常宮頸組織中的表達(dá)（±s）Table 1 HIF－2αand VEGF mRNA level in Squamous Carcinoma of the Cervix（SCC）group and normal cervical tissues（±s）

表1 HIF－2α與VEGF m RNA在宮頸鱗癌及正常宮頸組織中的表達(dá)（±s）Table 1 HIF－2αand VEGF mRNA level in Squamous Carcinoma of the Cervix（SCC）group and normal cervical tissues（±s）

a，compared with normal cervical tissues group，t＝11.672，P＜0.01；b，compared with normal cervical tissues group，t＝10.628，P＝0.006.

VEGF Group Case number HIF－2α Squamous Carcinoma of the Cerimages/BZ_235_756_1864_757_1871.pngvix 64 1.3418±0.812a 4.4543±2.585b Normal cervical tissue 22 0.1375±0.087 0.9127±0.382

圖1 HIF－2α、VEGF m RNA在子宮頸鱗癌組與正常宮頸組織中的表達(dá)Fig.1 The mRNA levels of HIF－2αand VEGF in Squamous Carcinoma of the Cervix group and normal cervical tissues

圖2 子宮頸鱗癌組HIF－2α與VEGF之間的關(guān)系Fig.2 The relationship of HIF－2αand VEGF in Squamous Cardmoma of the Cervix group

表2 病例組HIF－2α與VEGF m RNA表達(dá)pearson相關(guān)性檢驗(yàn)分析Table 2 The pearson correlation analysis of HIF－2αand VEGF m RNA levels between Squamous Carcinoma of the Cervix（SCC）group and normal cervical tissues

表3 HIF－2α在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)Table 3 The mRNA levels of HIF－2αand VEGF and Clinical pathological parameters in Squamous Carcinoma of the Cervix（SCC）group

2.宮頸鱗癌組織中 HIF－2α、VEGF mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

宮頸鱗癌組織中HIF－2αmRNA表達(dá)與臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均呈顯著的正相關(guān)（P＜0.05）；而與年齡無明顯的相關(guān)（P＞0.05，見表3）3.HIF－2α、VEGF蛋白在宮頸鱗癌組織、正常宮頸組織中的表達(dá)及其相關(guān)性分析

經(jīng)免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HIF－2α、VEGF蛋白陽性物質(zhì)為棕黃色顆粒，定位于胞漿，部分在胞核或胞膜上。HIF－2α、VEGF在宮頸鱗癌組織中陽性率分別為93.8%（60／64）和90.6%（58／64），均顯著高于正常宮頸組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表4，圖3－11）。

表4 HIF－2α、VEGF蛋白在宮頸鱗癌及正常宮頸組織中的表達(dá)Table 4 HIF－2αand VEGF protein expression in Squamous Carcinoma of the Cervix（SCC）group and normal cervical tissues

圖3 HIF－2α、VEGF蛋白在宮頸鱗癌及正常宮頸組織中的表達(dá)陽性率Fig.3 The positive rates of HIF－2αand VEGF protein expression in Squamous Carcinoma of the Cervix （SCC）group and normal cervical tissues

對(duì)64例宮頸鱗癌組織中HIF－2α和VEGF蛋白表達(dá)強(qiáng)度評(píng)分進(jìn)行等級(jí)相關(guān)分析，結(jié)果表明，HIF－2α蛋白的陽性水平與VEGF的陽性表達(dá)水平呈正相關(guān)（r＝0.514，P＜0.01）。結(jié)果見表5。

表5 HIF－2α和VEGF蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析Table 5 The correlation analysis of HIF－2αand VEGF protein in Squamous Carcinoma of the Cervix（SCC）group

討 論

缺氧誘導(dǎo)因子（hypoia－inducible factor，HIF）是實(shí)現(xiàn)腫瘤缺氧適應(yīng)最重要的一類調(diào)節(jié)因子。HIF是由α亞基和β亞基組成的異二聚體轉(zhuǎn)錄因子。α亞基是其功能性和活性亞基，被O2高度調(diào)節(jié)，β亞基是結(jié)構(gòu)性亞基，不受O2調(diào)節(jié)。目前已分離鑒定的α亞基有1α、2α、3α，均能與β亞基結(jié)合形成二聚體，分別組裝成HIF－1蛋白、HIF－2蛋白和HIF－3蛋白。在氧濃度正常時(shí)，HIF－α易被泛素－蛋白酶降解，使其在組織或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)量維持在較低水平；當(dāng)細(xì)胞氧濃度降低時(shí)，HIF－α降解過程受抑制，胞漿內(nèi)HIF－α積聚增多并發(fā)生核轉(zhuǎn)位，在細(xì)胞核中與β亞基結(jié)合形成有功能的二聚體，與目的基因特定系列缺氧反應(yīng)元件（hypoxia－response element，HRE）結(jié)合，從而激活目的基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮其生物學(xué)活性。缺氧誘導(dǎo)因子轉(zhuǎn)錄因子家族能隨著氧氣濃度的降低而調(diào)控多種基因［2］，參與與腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移細(xì)胞分化、細(xì)胞代謝及血管生成等過程［3，4］。Talks等［5］發(fā)現(xiàn)，HIF－2α蛋白幾乎不在正常人組織和器官中表達(dá)，但可在多種腫瘤細(xì)胞，包括子宮內(nèi)膜癌、膀胱癌、腎細(xì)胞癌、乳腺癌、肝癌、前列腺癌等癌細(xì)胞中表達(dá)。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是腫瘤刺激血管生長(zhǎng)的主要細(xì)胞因子之一［6］。人VEGF基因位于染色體6p12－p21區(qū)，由7個(gè)內(nèi)含子及8個(gè)外顯子組成，長(zhǎng)約14kb，形成5種異構(gòu)體，VEGFl21、VEGFl45、VEGFl65、VEGFl89、VEGF206。VEGF 分 子 量 為 40－46k Da，兩個(gè)相同亞基（分子量為20－23）通過二硫鍵連接構(gòu)成。VEGF與受體結(jié)合后能磷酸化自身細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的酪氨酸，增加鈣離子內(nèi)流，活化磷脂酶C，使細(xì)胞內(nèi)磷酸肌醇水平升高，直接刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，利于血管生成，而且腫瘤細(xì)胞脫落進(jìn)入血管和結(jié)締組織基質(zhì)中導(dǎo)致擴(kuò)散。VEGF與內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的囊泡小體結(jié)合，在細(xì)胞膜上形成“小孔”，促進(jìn)生物分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，增加血管滲透性，使血漿大分子外滲沉積在血管外基質(zhì)中，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、種植提供營(yíng)養(yǎng)。Lebrecht等［7］檢測(cè)宮頸癌患者血VEGF中發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)性宮頸癌患者血中VEGF水平明顯升高，Lee等［8］的研究表明VEGF具有促進(jìn)宮頸鱗癌血管形成的作用。

本研通過Real－time PCR和免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)宮頸鱗癌患者組HIF－2α與VEGF mRNA表達(dá)水平較正常宮頸組高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且m RNA檢測(cè)與蛋白檢測(cè)結(jié)果均顯示HIF－2α與VEGF表達(dá)呈一定強(qiáng)度的正相關(guān)（r＝0.778，P＜0.05，r＝0.514，P＜0.01）。Kim及 Kawanaka等研究小組［9，10］也先后發(fā)現(xiàn) HIF－2α在患者宮頸癌組織中高表達(dá)，且與放射治療的敏感性有關(guān)；但本研究結(jié)果表明，在宮頸鱗癌組織中HIF－2α與VEGF mRNA表達(dá)與年齡無明顯的相關(guān)（P＞0.05）；而與腫瘤的臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有顯著的正相關(guān)（P＜0.05）。也有研究認(rèn)為HIF－2α更具有腫瘤組織特異性，在小細(xì)胞肺癌中，HIF－2α低表達(dá)，且 HIF－2α壓抑后不影響癌細(xì)胞的存活［11］；而在非小細(xì)胞肺癌中高表達(dá)HIF－2α的病人預(yù)后差，且生存期明顯縮短［12］。還有研究認(rèn)為HIF－2α更易與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因的增強(qiáng)子結(jié)合，與VEGF m RNA的表達(dá)高度相關(guān)［13］；HIF－1α對(duì)腫瘤缺氧環(huán)境中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)主要通過能量保護(hù)機(jī)制，而HIF2α的促生長(zhǎng)效應(yīng)更有助于缺血組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管異生［14］。此外，在對(duì)某些細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，HIF－1α和HIF－2α有特定的時(shí)間和功能的作用，HIF－1α主要介導(dǎo)急性缺氧適應(yīng)，而 HIF－2α主要介導(dǎo)慢性缺氧適應(yīng)［15，16］。綜合分析本研究結(jié)果，我們認(rèn)為HIF－2α與VEGF均參與了宮頸癌的發(fā)生過程，且HIF－2α有可能通過調(diào)控VEGF表達(dá)水平參與了子宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移，而HIF－2α與VEGF在正常宮頸組織中均表達(dá)甚微。本研究為探索子宮頸鱗癌防治方法提供了新思路及理論依據(jù)。

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