田 野 徐 瑩 付 勤

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院脊柱關(guān)節(jié)骨科；1中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，沈陽110004）

骨關(guān)節(jié)炎是一種嚴(yán)重危害人類健康的關(guān)節(jié)疾病，其特點(diǎn)為關(guān)節(jié)軟骨退變和骨贅形成，至疾病后期，經(jīng)常導(dǎo)致病人疼痛較重和關(guān)節(jié)活動(dòng)障礙，嚴(yán)重影響生存質(zhì)量［1］。隨著我國(guó)逐步步入老齡化社會(huì)，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率逐年增加。然而，到目前為止，臨床上還沒有發(fā)現(xiàn)任何藥物能夠從根本上抑制骨關(guān)節(jié)炎的疾病進(jìn)展，抑制軟骨細(xì)胞終末期成熟分化的藥物仍然停留于基礎(chǔ)性的實(shí)驗(yàn)研究之中［2］。

在離體軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)中，研究者遇到的最大難題是如何維持軟骨細(xì)胞的軟骨表型特征，尤其是骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，其本身即具有自發(fā)性終末期成熟分化的特征。在傳統(tǒng)的低密度單層培養(yǎng)條件下，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞很快即失去其原始軟骨細(xì)胞表型特征［3］，明顯改變的生物學(xué)行為常使得實(shí)驗(yàn)研究無法進(jìn)行下去。

為了使軟骨細(xì)胞的表型特征維持下去，有學(xué)者嘗試了各種不同的培養(yǎng)方法，其中高密度微團(tuán)（Micromass）培養(yǎng)法是一種經(jīng)常采用的研究方法。有關(guān)軟骨細(xì)胞的Micromass培養(yǎng)法，最初應(yīng)用于研究長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板內(nèi)的軟骨細(xì)胞的增生、分化和退變性變化［4，5］；也有應(yīng)用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，研究軟骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞間相互作用的報(bào)道［6］。但是，Micromass培養(yǎng)法對(duì)于人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞分化的影響，目前還不完全清楚。

在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞向終末期成熟分化的過程中，成軟骨因子Col 2和Aggrecan的表達(dá)逐漸減弱；而促成熟分化因子堿性磷酸酶（ALP）及 MMP－13的表達(dá)則逐漸增強(qiáng)。本研究擬分離人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，分別進(jìn)行低密度單層培養(yǎng)和高密度Micromass培養(yǎng)，比較兩種培養(yǎng)條件下軟骨細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、ALP染色強(qiáng)度和Col 2、Aggrecan、ALP及 MMP－13等基因的表達(dá)水平，闡明人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞在高密度Micromass培養(yǎng)狀態(tài)下的分化特征。

材料和方法

1.實(shí)驗(yàn)材料和主要試劑

骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織（來自全膝關(guān)節(jié)置換病人截骨片）；DMEM／F12培養(yǎng)液（Gibco公司）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（FBS，Hyclone）；鏈霉蛋白酶和二型膠原酶（上海艾研生物科技有限公司）；ALP染色one－step試劑（Pierce公司）；RNeasy試劑盒（Qiagen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen公司）；SYBR Green（Applied Biosystems公司）；Col 2兔抗人單克隆抗體（santa cruz biotechnology公司）；Aggrecan兔抗人單克隆抗體（abcam公司）；ALP兔抗人單克隆抗體（santa cruz biotechnology 公司）；MMP－13 兔抗人單克隆抗體（abcam公司）；β－actin兔抗人單克隆抗體（Sigma公司）。

2.方法

2.1 細(xì)胞分離

切取膝關(guān)節(jié)置換病人截骨片表面關(guān)節(jié)軟骨組織，置于30%FBS DMEM／F12培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2孵箱中孵育1 h；吸除培養(yǎng)液，將軟骨組織切成約5 mm大小碎塊，PBS沖洗1次，加入鏈霉蛋白酶（1 mg／ml），37℃水浴震蕩1.5 h；PBS沖洗3次，加入二型膠原酶（2 mg／ml），置于37℃、5%CO2孵箱中孵育過夜；通過0.7μm過濾器過濾，收集濾過液，2200 rpm離心7 min，收集沉淀，重懸細(xì)胞，分別以不同濃度將細(xì)胞種植于6孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

2.2 細(xì)胞分組培養(yǎng)：將細(xì)胞分為兩組

低密度單層培養(yǎng)法為，以2.5×105／ml，將細(xì)胞均勻種植于6孔培養(yǎng)板中，每孔加入培養(yǎng)液2 ml；

高密度 Micromass培養(yǎng)法為，以250×105／ml濃度的細(xì)胞，每孔20μl，將細(xì)胞混懸液輕輕置于培養(yǎng)孔中心位置，放入孵箱中2 h后，每孔加入培養(yǎng)液2 ml［7］。

兩組細(xì)胞均隔日換液1次，并觀察細(xì)胞形態(tài)變化。于培養(yǎng)后第2日開始，隔日1次進(jìn)行ALP染色和RT－PCR實(shí)驗(yàn)。

2.3 堿性磷酸酶染色

吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗2次，于室溫下以10%中性福爾馬林固定細(xì)胞15 min；吸除福爾馬林，PBS清洗2次，加入ALP one－step染色劑，于37℃孵育45 min；吸除染色劑，PBS清洗2次，室溫下自然干燥過夜。

2.4 RNA 提取和 Real－time PCR

用RNeasy試劑盒提取細(xì)胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后稀釋3倍，取1μl稀釋后的c DNA進(jìn)行Real－time PCR反應(yīng)。特異性人類引物序列如下：Col 2：Sense：GATGATAGGTAAGGCTGTT ；Antisense：AACAGCGGAAGCTTGGCCG；Aggrecan：Sense：GTAGAATGG GGATGATTGGC，Antisense：AGTGAACGATGGACGGTTGG；ALP：Sense：CCTGACCCTCCATTTCTCTC， Antisense： ATCCTCTAGTCTCTCCTGGG； MMP－13：Sense：AAGTCCCCGTAAAGGTCCG，Antisense：AAGCCATTAAGTACAAATG ；β－actin：Sense：GCAGAGATCAGCAAGATGTG；Antisense：CGTTTCAAGTTAGGGTGTCA。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性15 min后，95℃變性20 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共45個(gè)循環(huán)，于72℃延伸階段檢測(cè)熒光產(chǎn)物，生成擴(kuò)增曲線。在同一次反應(yīng)中，各組均設(shè)3個(gè)平行重復(fù)。以 β－actin為內(nèi)參基因，通過Rotor Gene分析軟件進(jìn)行定量分析。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

全部數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t檢驗(yàn)；當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.低密度單層培養(yǎng)條件下人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的分化特

從形態(tài)學(xué)觀察，人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖緩慢，于第6d時(shí)達(dá)到70－80%細(xì)胞融合，其大部分細(xì)胞失去了軟骨細(xì)胞形態(tài)的特征，而呈長(zhǎng)梭形或長(zhǎng)橢圓形（圖1）。ALP染色顯示，細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性逐漸增強(qiáng)，至第6日，堿性磷酸酶染色強(qiáng)度已達(dá)到較高程度（圖2）。RT－PCR顯示，軟骨細(xì)胞的兩個(gè)標(biāo)志性因子Col 2和Aggrecan的mRNA的表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)明顯減弱；而促成熟分化因子ALP和MMP－13的表達(dá)則隨時(shí)間明顯增強(qiáng)（圖3）。以上結(jié)果表明，在低密度單層培養(yǎng)條件下，人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞具有自發(fā)性成熟分化的特征。

2.高密度Micromass培養(yǎng)對(duì)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞形態(tài)的影響

通過隔日一次顯微鏡下對(duì)細(xì)胞形態(tài)的觀察，我們發(fā)現(xiàn)，與同一時(shí)間點(diǎn)低密度單層培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞相比，高密度Micromass培養(yǎng)條件下的細(xì)胞形態(tài)更加保持了軟骨細(xì)胞圓形或橢圓形的形態(tài)特征；時(shí)間點(diǎn)越偏后，二者之間的差距越大（圖1）。雖然高密度Micromass培養(yǎng)的細(xì)胞也隨時(shí)間緩慢失去軟骨細(xì)胞形態(tài)，但此種過程明顯減緩。

圖1 人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞在低密度單層和高密度Micromass培養(yǎng)條件 下的形態(tài)變化Fig.1 Morphology of human osteoarthritic chondrocytes on low－density monolayer and high－density micromass culture

圖2 人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞在低密度單層和高密度Micromass培養(yǎng)條件 下的ALP染色Fig.2 ALP staining of human osteoarthritic chondrocytes on low－density monolayer and high－density micromass culture

3.高密度Micromass培養(yǎng)對(duì)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞ALP染色的影響

Micromass培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)，ALP染色強(qiáng)度增長(zhǎng)緩慢。在同一時(shí)間點(diǎn)，與低密度單層培養(yǎng)條件下的細(xì)胞相比，高密度 Micromass方法培養(yǎng)的細(xì)胞，ALP染色強(qiáng)度減低；尤其是于第6 d，低密度培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)ALP染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，Micromass的細(xì)胞染色強(qiáng)度仍然較低，只在微團(tuán)周圍出現(xiàn)少量染色增強(qiáng)（圖2）。雖然低密度培養(yǎng)條件下細(xì)胞通透性高，高密度培養(yǎng)條件下的細(xì)胞密度較大，細(xì)胞通透性低，大體觀察ALP染色強(qiáng)度應(yīng)該較低密度的細(xì)胞高，但是在同一時(shí)間點(diǎn)與低密度培養(yǎng)條件下的細(xì)胞相比，染色強(qiáng)度反而較低，進(jìn)一步說明，高密度Micromass培養(yǎng)降低細(xì)胞內(nèi)ALP的活性，延緩骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞成熟分化的進(jìn)程。

4.高密度Micromass培養(yǎng)對(duì)人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞內(nèi)成軟骨和促成熟分化因子基因表達(dá)的影響

RT－PCR結(jié)果顯示，于第4 d和第6 d，Micromass培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞內(nèi)成軟骨因子Col2和Aggrecan mRNA的表達(dá)，顯著高于低密度單層培養(yǎng)下的細(xì)胞，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而促成熟分化因子ALP和MMP－13 mRNA的表達(dá)，則顯著低于低密度單層培養(yǎng)下的細(xì)胞，二者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞在低密度單層和高密度Micromass培養(yǎng)條件 下的細(xì)胞因子基因表達(dá)P＜0.05Fig.3 Marker genes expression of human osteoarthritic chondrocytes on low－density monolayer and high－density micromass culture＊denotes P＜0.05

討 論

在有關(guān)骨關(guān)節(jié)炎的體外實(shí)驗(yàn)中，人類關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞經(jīng)常作為研究的對(duì)象，建立為細(xì)胞模型［8，9］。但是，在常規(guī)單層培養(yǎng)條件下的軟骨細(xì)胞具有明顯的缺陷：增殖緩慢和隨培養(yǎng)時(shí)間而成熟分化，這使得應(yīng)用人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作為研究對(duì)象的實(shí)驗(yàn)具有明顯的局限性［10］。尤其是人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，其增殖更加緩慢，隨培養(yǎng)時(shí)間出現(xiàn)的成熟分化現(xiàn)象，也表現(xiàn)得更加顯著，此種情況經(jīng)常導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無法正常進(jìn)行下去。

為了使骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的軟骨特征能夠較長(zhǎng)時(shí)間的持續(xù)下去，我們應(yīng)用高密度Micromass培養(yǎng)法培養(yǎng)細(xì)胞。這種培養(yǎng)方法曾經(jīng)被應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)的實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，研究者應(yīng)用軟骨細(xì)胞微團(tuán)探討軟骨組織的形成和再生條件［11，12］；同時(shí)也作為軟骨缺損后修復(fù)的移植物，應(yīng)用于臨床研究［13］。

在我們的實(shí)驗(yàn)中，通過臨床獲得骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，首先分離獲得人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞，然后將細(xì)胞分別進(jìn)行低密度單層培養(yǎng)和高密度 Micromass培養(yǎng)。為了說明軟骨細(xì)胞的分化狀態(tài)，我們?nèi)匀徊捎脵z測(cè)細(xì)胞內(nèi)成軟骨因子基因表達(dá)水平的方法。在軟骨細(xì)胞的分化過程中，Col2和Aggrecan是兩個(gè)最為重要的成軟骨化因子，其在軟骨細(xì)胞的增生和分化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，此二因子基因表達(dá)的增強(qiáng)，表明細(xì)胞具有軟骨細(xì)胞分化的特征［14］。有研究表明，在骨關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)，軟骨細(xì)胞經(jīng)歷著與長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板內(nèi)的軟骨細(xì)胞一樣的變化，即成熟分化［15］。經(jīng)研究證實(shí)，ALP是軟骨細(xì)胞成熟分化的重要標(biāo)志性蛋白，ALP表達(dá)的增強(qiáng)即表明軟骨細(xì)胞具有成熟分化的趨勢(shì)。另外，在骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中，MMP－13的表達(dá)也顯著增高，故而是骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的又一標(biāo)志性因子［16］。對(duì)于ALP和MMP－13基因和蛋白表達(dá)的抑制，則表明軟骨細(xì)胞成熟分化的作用得到一定程度的抑制。

與以往的研究結(jié)果相一致［7，9］，本研究中低密度單層培養(yǎng)的骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞內(nèi)，Col2和Aggrecan的表達(dá)逐漸降低，而ALP和MMP－13的表達(dá)則逐漸增強(qiáng)，表明在常規(guī)培養(yǎng)條件下骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞具有自發(fā)性終末期成熟分化的特征。為探討高密度Micromass培養(yǎng)方法對(duì)于軟骨細(xì)胞分化的影響，我們首先觀察了兩組細(xì)胞間形態(tài)的不同變化。通過倒置顯微鏡的觀察結(jié)果，我們初步發(fā)現(xiàn)Micromass培養(yǎng)條件下的細(xì)胞形態(tài)變化較小，更接近于軟骨細(xì)胞的形態(tài)特征。

為明確細(xì)胞內(nèi)促成熟分化因子ALP的變化，我們對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行了ALP染色。ALP染色結(jié)果顯示，雖然Micromass培養(yǎng)條件下細(xì)胞密度較高，細(xì)胞通透性低，但是其在同一培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)與低密度培養(yǎng)相比，ALP染色強(qiáng)度卻反而減低。尤其是于第6 d，兩組細(xì)胞的染色強(qiáng)度差距出現(xiàn)了明顯的區(qū)別。在Micromass培養(yǎng)條件下，細(xì)胞團(tuán)周邊出現(xiàn)了部分染色增強(qiáng)的區(qū)域，可能與周邊部細(xì)胞密度減低，其細(xì)胞分化特征類似于單層培養(yǎng)條件下的細(xì)胞分化特征有關(guān)。

為了在基因水平進(jìn)一步證明兩種培養(yǎng)條件下細(xì)胞的不同分化特征，我們收集兩組細(xì)胞進(jìn)行了RTPCR實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)表明，高密度Micromass培養(yǎng)條件下的軟骨細(xì)胞內(nèi)，成軟骨因子Col2和Aggrecan的表達(dá)，強(qiáng)于低密度單層培養(yǎng)條件下的細(xì)胞；而促成熟分化因子ALP和MMP－13的表達(dá)則剛好相反，Micromass組細(xì)胞內(nèi)該二因子表達(dá)顯著降低。

綜上所述，高密度Micromass培養(yǎng)條件下，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞可在一定時(shí)間內(nèi)保留軟骨細(xì)胞的分化特征，其終末期成熟分化的趨勢(shì)得到一定程度的抑制。由于本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間較短，因此此種培養(yǎng)條件下更長(zhǎng)時(shí)間的細(xì)胞分化狀態(tài)，還有待于進(jìn)一步研究。

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