徐 瑩 田 野 趙 平

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院麻醉科，1中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院脊柱關(guān)節(jié)骨科，沈陽110004）

急性肺損傷、間質(zhì)性肺疾病，臨床表現(xiàn)為呼吸困難，肺彌散功能減低，低氧血癥，X線表現(xiàn)為彌漫性陰影。目前臨床上缺乏有效的治療及阻止病程進展的良好方法，因而是一種病死率很高的難治性疾病。在藥物治療的基礎(chǔ)上，近年來間充質(zhì)干細(xì)胞的治療逐漸成為熱點。因為肺臟原位干細(xì)胞數(shù)量較少，且其表型特征和龕位分布很難發(fā)現(xiàn)，同時肺臟的結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜，所以目前有關(guān)肺臟干細(xì)胞的研究進展緩慢。但現(xiàn)在已有報道，成體組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以歸巢至肺臟并長期定植，通過對定植于肺部的成體組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表達特異性I型肺泡上皮細(xì)胞的標(biāo)志，包括水通道蛋白—5等的檢測，也證實了其它干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肺組織細(xì)胞的可能性。最近的研究提示，在骨髓組織中存在一種多能基質(zhì)干細(xì)胞，具備向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等分化的能力，其生物學(xué)性狀穩(wěn)定，可長期增殖，這種細(xì)胞有可能成為干細(xì)胞治療的種子細(xì)胞來源。林群等將轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）經(jīng)頸內(nèi)靜脈注入大鼠體內(nèi)，經(jīng)檢測后證實其具有較好的肺內(nèi)靶向性。本研究目的在于，通過對成體骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞在損傷肺部的分布和定植情況的研究，以期對急性肺損傷、間質(zhì)性肺疾病等難治性肺部疾病的治療提供新思路。

材料和方法

1.實驗動物和主要試劑

清潔級wistar大鼠，4－6周齡，體重150－200克，雌雄不限（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實驗動物中心提供）。DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）；標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（Hyclone公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；Percoll分 離 液 （Pharmacia 公 司）；CD29、CD44、CD34、CD45兔抗大鼠多克隆抗體（武漢博士德公司）；FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗（武漢博士德公司）；脂多糖（sigma公司）；蘇木素（西塔化學(xué)試劑公司）；伊紅（西塔化學(xué)試劑公司）；二甲苯（西塔化學(xué)試劑公司）；無水酒精（西塔化學(xué)試劑公司）；中性樹膠（西塔化學(xué)試劑公司）；鼠抗尿嘧啶脫氧核苷單克隆抗體（中杉金橋公司）；免疫組化試劑盒（中杉金橋公司）。

2.方法

2.1 BMSCs的體外分離和培養(yǎng)

選用6周齡健康Wister大鼠（約150克），頸椎脫臼法處死，無菌條件下分離股骨脛骨，咬去骨兩端，用10ml L－DMEM培養(yǎng)基（無血清），沖出骨髓于離心管中，吹打制成細(xì)胞懸液。1000 rpm／min，離心10 min，棄上清，再加入10ml L－DMEM培養(yǎng)基吹打制成細(xì)胞懸液，同樣方法離心，棄上清。用LDMEM 3m L重懸細(xì)胞，將懸液貼壁輕輕加入到預(yù)置等體積Percoll分離液（1.073g／m L）的離心管中，2500rpm／min，離心25min。收集云霧狀白膜層的單個核細(xì)胞，用L－DMEM洗滌兩次（1000rpm／min，離心5min），用 L－DMEM 培養(yǎng)基（含 15%FBS、100U／ml青、鏈霉素）重懸。接種后24時首次換液，以后每3天換液，8－12天達到80－90%融合時消化傳代。

2.2 BMSCs的鑒定

將BMSCs培養(yǎng)至2代后，取2代細(xì)胞，以2×104傳代于24孔板中，加500μl培養(yǎng)基。于37℃、5%CO2培養(yǎng)至細(xì)胞70%－80%融合時進行細(xì)胞鑒定。取8孔細(xì)胞，去除培養(yǎng)液后PBS清洗3遍，濾紙吸干表面液體，加入500μl 4%的多聚甲醛固定10 min。10min后PBS清洗3遍，濾紙吸干表面液體，分別向8孔內(nèi)滴加CD29、CD44、CD34、CD45兔抗大鼠多克隆抗體（1∶100）300μl，4℃孵育過夜，次日棄去一抗，PBS清洗3遍后向每孔加入300μl山羊抗兔FITC標(biāo)記的二抗（1∶100），室溫孵育2h后棄去二抗，PBS清洗3遍，濾紙吸干表面液體，熒光顯微鏡下觀察并照相。

2.3 急性肺損傷大鼠動物模型建立及分組

20只大鼠隨機分為兩組：A組 肺損傷組（只注射脂多糖）；B組 肺損傷后干細(xì)胞修復(fù)組（注射脂多糖和干細(xì)胞）。脂多糖以注射用水稀釋成0.5mg／ml，按照2mg／kg經(jīng)大鼠尾靜脈注入；取培養(yǎng)第2代骨髓干細(xì)胞，與溴脫氧尿嘧啶溶液共同培養(yǎng)24h，使溴脫氧尿嘧啶整合于骨髓干細(xì)胞內(nèi)后，以適當(dāng)生理鹽水混合，B組每只大鼠經(jīng)尾靜脈注入0.2ml（含有2.5×106個細(xì)胞）；另有2只大鼠：1只為正常對照，不注射任何試劑；1只為干細(xì)胞對照，只注射干細(xì)胞。觀察比較大鼠呼吸狀態(tài)，呼吸頻率，活動狀態(tài)，攝食情況，口鼻分泌物情況。于第5日指標(biāo)觀察后，放血法處死大鼠，取肺組織觀察比較。

2.4 肺組織病理切片制備和觀察

以10%福爾馬林溶液浸泡大鼠肺組織（肺組織均取自左肺上葉，大小約1×1×1cm3）固定48 h，進行脫水處理。脫水時間分別為：75%酒精缸，80%酒精缸，90%酒精缸，95%酒精缸，100%酒精Ⅰ缸，100%酒精Ⅱ缸，時間分別為1h；二甲苯Ⅰ缸，二甲苯Ⅱ缸，兩個缸一起為1 h，然后分別經(jīng)浸蠟Ⅰ缸和浸蠟Ⅱ缸各浸蠟1 h，將標(biāo)本變?yōu)橄瀴K；將標(biāo)本蠟塊經(jīng)切片機切成4 mm后的病理標(biāo)本片，于38℃經(jīng)展片機展片，于70℃經(jīng)烤片機烤片4 h；再分別經(jīng)二甲苯Ⅰ缸4 min，二甲苯Ⅱ缸4 min，二甲苯缸Ⅲ4分鐘，100%酒精Ⅰ缸，100%酒精Ⅱ缸，95%酒精缸，75%酒精缸，脫蠟數(shù)秒。

2.5 HE染色和免疫組化染色

HE染色：先將脫蠟的切片經(jīng)蘇木素染色5 min，反蘭3 min鐘，經(jīng)1%鹽水酒精浸泡30 s，伊紅染色7 min，自來水沖洗；分別經(jīng)70%酒精缸3 s，90%酒精缸3 s，100%酒精Ⅰ缸4 min，100%酒精Ⅱ缸4 min，二甲苯Ⅰ缸4 min，二甲苯Ⅱ缸4 min，進行脫色處理；用中性樹膠封片。

免疫組織化學(xué)染色：蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min鐘；3%H2O2去離子水孵育5－10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫孵育10－15 min，傾去；滴加適當(dāng)比例稀釋的鼠抗尿嘧啶脫氧核苷單克隆抗體，37℃孵育2－3 min或4℃過夜；PBS沖洗，3 min×3次；滴加生物素化二抗工作液，室溫或37℃孵育10－15 min；PBS沖洗，3 min×3次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫或37℃孵育10－15 min；PBS沖洗，3分鐘×3次；顯色劑顯色；自來水充分沖洗；用中性樹膠封片。

以O(shè)lympus光學(xué)顯微鏡分別于低倍鏡（×10）和高倍鏡（×40）下，觀察比較大鼠肺組織病理切片。

3.統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1.大鼠BMSCs培養(yǎng)形態(tài)觀察結(jié)果

原代細(xì)胞培養(yǎng)24h后可見到細(xì)胞多數(shù)呈小圓形，少量貼壁且伸出突起的細(xì)胞，呈小的短梭形或三角形。第3d起伸出突起細(xì)胞增多，呈集落多細(xì)胞性分布，可見分裂相。4、5天開始形成分布均勻的團簇狀增生灶，且數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞形態(tài)呈較大的長梭形，排列較緊密，培養(yǎng)的第5天即可見散在的細(xì)胞群落形成；第9－10天細(xì)胞生長即可達80%－90%的融合，呈很大的長梭形，緊密排列可有旋渦狀形成。第2代后細(xì)胞的形態(tài)比較均一（圖1）。

3.指標(biāo)觀察統(tǒng)計結(jié)果

正常對照和干細(xì)胞對照大鼠呼吸狀態(tài)及活動性良好。A、B兩組均有部分大鼠呼吸困難，呼吸頻率加快，不活動和不進食，口鼻有粉紅色分泌物。但A組數(shù)量更多，呼吸頻率加快更明顯，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1、2）。A組有4只大鼠于處死前死亡，其中1只為注射后立即死亡，故未列入統(tǒng)計范圍內(nèi)。

4.大鼠肺組織病理觀察結(jié)果

大體觀察：正常對照和干細(xì)胞對照大鼠肺臟無異常。A、B兩組大鼠肺臟均出現(xiàn)不同程度淤血水腫，但A組程度更重，且有3只大鼠肺臟出現(xiàn)了肉眼可見的實變改變。

HE染色：正常對照和干細(xì)胞對照大鼠肺病理切片顯示，肺組織無損傷出現(xiàn)，肺泡結(jié)構(gòu)正常（圖3）A組大鼠肺臟病理切片顯示，肺組織明顯水腫充血，部分肺泡腔內(nèi)滲出、充血、肺泡萎陷不張；肺泡間隔增寬，毛細(xì)血管擴張充血，部分肺臟出現(xiàn)實變的情況（圖3）；B組大鼠肺臟病理切片顯示，肺組織也出現(xiàn)了水腫和充血情況，部分肺泡腔內(nèi)也有滲出、充血、肺泡萎陷，但較A組為輕，且無肺實變情況發(fā)生（圖3）。

表1 兩組大鼠觀察指標(biāo)比較Table 1 Observation index of two groups

表2 兩組大鼠呼吸頻率比較（次／分）Table 2 Respiratory rates of two groups（beat／min）

圖1 原代培養(yǎng)的BMSCs（a）和第2代培養(yǎng)的BMSCs（b）（×10）Fig.1 Primary BMSCs（a）and BMSCs of second generation（b）（×10）

圖3 正常對照（a）、干細(xì)胞對照（b）、肺損傷組（c－k）和干細(xì)胞修復(fù)組（l－u）大鼠肺臟病理 HE染色（×10）Fig.3 Lungs pathology of control（a），stem cell control（b），A group（c－k）and B group（l－u）HE staining（×10）

圖2 免疫熒光法檢測BMSCs表面標(biāo)志物結(jié)果Fig.2 BMSCs surface markers detection by immunofluorescence

圖4 正常對照（a）、干細(xì)胞對照（b）、肺損傷組（c）和干細(xì)胞修復(fù)組（d）肺臟病理 免疫組化（×40）Fig.4 Lungs pathology of control（a），stem cell control（b），A group（c）and B group（d）immunohistochemistry（×40）

2.大鼠BMSCs的鑒定

免疫熒光法檢測BMSCs CD29、CD44呈陽性反應(yīng)，CD34、CD45呈陰性反應(yīng)（圖2）。

免疫組化染色：正常對照和干細(xì)胞對照大鼠肺病理切片顯示，肺組織無損傷出現(xiàn)，于干細(xì)胞對照大鼠肺病理切片可發(fā)現(xiàn)呈長圓形或梭形較大細(xì)胞，其細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒（圖4），表明骨髓干細(xì)胞確于肺內(nèi)定植；A組大鼠肺臟病理切片顯示，肺組織內(nèi)無細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒細(xì)胞（圖4）；B組大鼠肺臟病理切片顯示，肺組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)呈長圓形或梭形較大細(xì)胞，其細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒（圖4），表明骨髓干細(xì)胞確于肺內(nèi)定植。

討 論

BMSCs是多分化潛能的干細(xì)胞，在一定誘導(dǎo)條件下，可以形成骨、軟骨或脂肪等組織，因此是組織工程的種子細(xì)胞［1，2］，目前是研究的熱點。到目前為止，BMSCs的培養(yǎng)和分離方法有很多種，比較常用的方法是密度梯度離心法［3］、貼壁細(xì)胞分離法、流式細(xì)胞儀法［4］和免疫磁珠分離法［5］。作為組織工程的種子細(xì)胞，細(xì)胞的純度越高越能符合組織工程研究的要求，實驗中我們把密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合，用比重為1.073 g／ml的percoll分離液分離骨髓MSCs，隨換液棄除血細(xì)胞。具有操作簡便、快速、實用等優(yōu)點，禰補了流式細(xì)胞儀和免疫磁珠分離法影響細(xì)胞活性，單純貼壁法所得的BMSCs的純度不足的缺點，是一種比較理想的分離純化方法。

近期研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs還沒有一種特異的表面標(biāo)記，故無法直接鑒定，本實驗中我們采用免疫熒光法進行鑒定，CD29、CD44表達陽性，CD34、CD45表達陰性，與文獻相符合［6］。說明分離的細(xì)胞純度較高，成份比較單一，不是造血細(xì)胞和成纖維細(xì)胞，而是BMSCs。

目前大鼠肺損傷動物模型的建立有很多種方法，如經(jīng)137銫照射300cGy，注射油酸或博來霉素等。本研究采用脂多糖經(jīng)大鼠尾靜脈注入的方法，按照2mg／kg給藥，除A組1只大鼠于給藥后立即死亡外，其余大鼠均存活數(shù)日，處死后其肺組織病理切片均出現(xiàn)肺部水腫充血及部分實變情況，說明脂多糖可以造成大鼠急性肺損傷。

急性肺損傷起病急，發(fā)展迅速，病情兇險，治療困難。治療急性肺損傷的方法目前臨床上有很多種，但各種方法均有其不足之處，且對于急性肺損傷的治療效果非常有限，因而急性肺損傷是一種病死率很高的難治性疾病。在藥物治療的基礎(chǔ)上，近年來間充質(zhì)干細(xì)胞的治療逐漸成為熱點。因為肺臟原位干細(xì)胞數(shù)量較少，且其表型特征和龕位分布很難發(fā)現(xiàn)，同時肺臟的結(jié)構(gòu)和功能復(fù)雜，所以目前有關(guān)肺臟干細(xì)胞的研究進展緩慢［7］。但現(xiàn)在已有報道，成體組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可以歸巢至肺臟并長期定植［8］，通過對定植于肺部的成體組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表達特異性I型肺泡上皮細(xì)胞的標(biāo)志，包括水通道蛋白—5等的檢測，也證實了其它干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肺組織細(xì)胞的可能性［9］。本研究經(jīng)大鼠尾靜脈注入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后，經(jīng)肺病理切片免疫組化檢查證實干細(xì)胞確于肺內(nèi)歸巢定植，且其對急性肺損傷確有修復(fù)保護作用。由于干細(xì)胞具有自我更新及多向分化能力，且具有取材容易，細(xì)胞增殖快速，生物學(xué)性狀穩(wěn)定，便于自體移植等特點，近年來在基因治療肺損傷中倍受重視［10，11］。目前有研究表明，BMSCs對于矽肺大鼠模型肺臟的損傷和纖維化，具有明顯的抑制作用［12］；通過對高氧所致新生大鼠肺損傷的研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs可以明顯抑制損傷肺臟的炎癥反應(yīng)，從而減輕高氧所致的肺損傷程度［13］，但是其具體機制目前還不完全清楚。隨著基因治療肺部疾患研究的不斷深入，相信干細(xì)胞介導(dǎo)的基因治療有望成為治療急性肺損傷的有效方法之一。

本研究存在的缺點和有待于研究的問題：①不同代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的肺內(nèi)歸巢活性是否相同［14］，如何檢查；②不同劑量脂多糖對大鼠肺損傷的程度有多大影響；③骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞大鼠肺內(nèi)定植期有多長，其影響因素是什么［15］。④由于本研究樣本量較小，因此骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對急性肺損傷大鼠肺臟的修復(fù)保護作用，其確切性和具體機制還有待于進一步研究確認(rèn)。

［1］Longobardi L，O＇Rear L，Aakula S，et al.Effect of IGF－I in the chondrogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells in the presence or absence of TGF－beta signaling.J Bone Miner Res，2006，21（4）：626－636

［2］Indrawattana N，Chen G，Tadokoro M，et al.Growth factor combination for chondrogenic induction from human mesenchymal stem cell.Biochem Biophys Res Commun，2004，320（3）：914－919

［3］Lisignoli G，Remiddi G，Cattini L，et al.An elevated number of differentiated osteoblast colonies can be ob－tained from rat bone marrow stromal cells using a gradient isolation procedure.Connect Tissue Res，2001，42（1）：49－57

［4］Zohar R，Sodek J.Characterization of stromal progenitor cells enriched by flow cytometry.Blood，1997，90（9）：3471－3481

［5］Encina NR，Billotte WG，Hofmann MC.Immunomagnetic isolation of osteoprogenitors from human bone marrow stroma.Lab Invest，1999，79（4）：449－457

［6］康新勤，藏偉進，宋土生等.大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及其形態(tài)觀察.西安交通大學(xué)學(xué)報，2003，24（5）：518－519

［7］Ortiz LA，Gambelli F，McBridge C，et al.Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100（14）：8407－8411

［8］Borthwick DW，Shahbazian M，Krantz QT，et al.Evidence for stem cell niches in the tracheal epithelium.AmJ Respir Cell Mol Biol，2001，24（6）：66－70

［9］Prockop DJ，Gregory CA，Spees JL.One strategy for cell and gene therapy：harnessing the power of adult stem cells to repair tissues.Proc Natl Acad Sci USA，2003，100 Suppl 1：11917－11923

［10］Kotton DN，Ma BY，Cardoso WV，et al.Bone marrow2derived cells as progenitors of lung alveolar epithelium.Development，2001，128（24）：518－523

［11］Han ZB，Chen HX，Deng JX.Multipotential differentiation and potential applications of adipose－derived stem cells.Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao，2007，23（20：195－200

［12］Zhao MM，Cui JZ，Cui Y，et al.Therapeutic effect of exogenous bone marrowderived mesenchymal stem cell transplantation on silicosis via paracrine mechanisms in rats.Mol Med Rep，2013，8（3）：741－746

［13］Tian Z，Li Y，Ji P，Zhao S，et al.Mesenchymal stem cells protects hyperoxia－induced lung injury in newborn rats via inhibiting receptor for advanced glycation endproducts／nuclear factorκB signaling.Exp Biol Med（Maywood），2013，238（2）：242－247

［14］Amamoto N，Akamatsu H，Haseqawa S，et al.Isolation of multipotent stem cells from mouse adipose tissue.Dermatol Sci，2007，48（1）：43－52

［15］林群，雷麗華，曾幫雄等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)大鼠肺內(nèi)基因轉(zhuǎn)移的可行性.中華麻醉學(xué)雜志，2006，26（3）：230－233