鐘 華，吳雪艷，劉迪群

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001)

結(jié)腸癌是我國(guó)最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,其發(fā)病率位居第二位,僅次于胃癌,且近年呈現(xiàn)年輕化及上升趨勢(shì)。細(xì)胞惡性增殖是惡性腫瘤的重要生物學(xué)特性之一，它與腫瘤的惡性程度直接相關(guān)。Kiss-1是繼nm23之后，Lee等[1]應(yīng)用微細(xì)胞介導(dǎo)的染色體雜交技術(shù)及差減雜交技術(shù)在人黑色素瘤細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因。其定位于染色體1q32-q41，基因序列中包含四個(gè)外顯子，其編碼的蛋白kisspeptin是由145個(gè)氨基酸組成的親水性多肽[2]。本研究旨在體外構(gòu)建高表達(dá)Kiss-1的人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞株(SW480)細(xì)胞株模型，擬探討Kiss-1基因?qū)Y(jié)腸癌增殖的影響，為結(jié)腸癌患者創(chuàng)造新的治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480(湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所惠贈(zèng))培養(yǎng)于含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于37 ℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。質(zhì)粒pEGFP-N1-Kiss-1及空載質(zhì)粒由上海吉?jiǎng)P公司合成，兩種質(zhì)粒均含有GFP綠色熒光,經(jīng)上海吉?jiǎng)P公司測(cè)序鑒定無(wú)誤。質(zhì)粒小提試劑盒為康為公司產(chǎn)品，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司，G418及CCK8試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司，兔抗人Kiss-1一抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，二抗購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司。

1.2 質(zhì)粒擴(kuò)增與提取

LB肉湯(Luria-Bertani,LB)2.5 g加入100 mL一級(jí)水中配置成25 mg/mL的LB液態(tài)培養(yǎng)基，高溫蒸汽消毒備用。培養(yǎng)基中加入卡那霉素，使其終濃度為30 μg/mL。質(zhì)粒pEGFP-N1-Kiss-1及空載質(zhì)粒各100 μL分別加入5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min震蕩16 h。提取純化質(zhì)粒并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒濃度。

1.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染

細(xì)胞生長(zhǎng)至90％～95％融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用無(wú)血清1640培養(yǎng)基將8 μg pEGFP-N1-Kiss-1質(zhì)粒和10 μL Lipofectamine2000分別稀釋至總體積為250 μL，室溫下靜置5 min。輕輕混勻兩種溶液，室溫下靜置20 min，將混合液加入SW480細(xì)胞中，37 ℃，5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。吸去培養(yǎng)基，PBS液洗兩遍，加入含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基終止轉(zhuǎn)染。42 h后更換完全培養(yǎng)基,加入500 μg/mL G418篩選，培養(yǎng)3～4天待細(xì)胞大量死亡時(shí)，降低G418濃度至300 μg/mL維持篩選4周左右,獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞?？蛰d體pEGFP-N1轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞作為陰性對(duì)照組。

1.4 Western blot鑒定Kiss-1在SW480細(xì)胞中的表達(dá)

分別提取空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組中SW480細(xì)胞總蛋白，用15％SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene Fluoride，PVDF膜)，麗春紅染色驗(yàn)證后用含5％血清的TBST封閉2 h，依次孵育對(duì)應(yīng)一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，最后暗室曝光顯像,檢測(cè)其中Kiss-1表達(dá)的變化。

1.5 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

已處對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞用0.25％胰酶消化，制成細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)(每孔2×103個(gè)細(xì)胞)定容至100 μL培養(yǎng)，每組細(xì)胞設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置3個(gè)空白孔(只含細(xì)胞培養(yǎng)基)。分別于0、24、48及72 h每孔加入5 μL CCK-8溶液，5％CO2及飽和濕度培養(yǎng)基繼續(xù)孵育2 h,檢測(cè)450 nm光譜下的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線用吸光值計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，繪制細(xì)胞增殖曲線圖。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒pEGFP-N1-Kiss-1的測(cè)序鑒定

經(jīng)上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司的序列測(cè)定分析，顯示合成的目的基因Kiss-1序列完全符合Gene Bank中Kiss-1 cDNA的序列(圖1)。

2.2 SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒及篩選

SW480細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后24 h,在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，可見(jiàn)綠色熒光。經(jīng)過(guò)4周的G418篩選，G418維持濃度為300 μg/mL,視野里幾乎所有細(xì)胞都帶有綠色熒光蛋白。停用G418一周，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光基本保持不變。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株篩選成功。

2.3 Western blot檢測(cè)Kiss-1在SW480細(xì)胞中的表達(dá)

提取SW480、SW480-pEGFP-N1和SW480-Kiss-1細(xì)胞中總蛋白，Western blot檢測(cè)Kiss-1蛋白kisspeptin的表達(dá)，可見(jiàn)kisspeptin在實(shí)驗(yàn)組的SW480細(xì)胞中高表達(dá)，而在空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組的SW480細(xì)胞中表達(dá)量低。結(jié)果表明，Kiss-1基因在SW480-Kiss-1細(xì)胞中能穩(wěn)定、高效表達(dá)。

2.4 CCK8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖能力

圖1 目的基因Kiss-1的測(cè)序圖譜位點(diǎn)72-489區(qū)間為目的基因序列

運(yùn)用CCK8法檢測(cè)Kiss-1對(duì)SW480細(xì)胞的增殖情況的影響。分別于種板0、24、48、72 h加入CCK8試劑，孵育2 h,用酶標(biāo)儀測(cè)定各組細(xì)胞的450 nm波長(zhǎng)吸光值(OD值)，繪制細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果顯示，培養(yǎng)24 h時(shí)各組細(xì)胞增殖能力間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。48 h后，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。而空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組間細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖2)。

圖2 CCK8法檢測(cè)Kiss-1對(duì)SW480細(xì)胞增殖能力的影響

3 討 論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞惡性增殖密切相關(guān)，細(xì)胞增殖失控級(jí)凋亡異常導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞壽命延長(zhǎng)。多種癌基因與抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程。Kiss-1是近來(lái)頗受關(guān)注的一種抑癌基因，其基因結(jié)構(gòu)由四個(gè)外顯子區(qū)域組成，外顯子Ⅰ與外顯子Ⅱ?yàn)榉蔷幋a區(qū)，外顯子Ⅲ的結(jié)構(gòu)依次為翻譯起始位點(diǎn)、38個(gè)非編碼堿基、及103個(gè)編碼堿基，外顯子Ⅳ含335個(gè)翻譯堿基、翻譯終止點(diǎn)、多腺苷酸化信號(hào)和121個(gè)非編碼堿基。先前有學(xué)者研究表明其對(duì)胃癌、腎細(xì)胞癌等多種人類惡性腫瘤有轉(zhuǎn)移抑制作用[3-5]。同時(shí)在小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤、胃癌等腫瘤細(xì)胞增殖過(guò)程中，Kiss-1也發(fā)揮著負(fù)性調(diào)節(jié)作用[4,6-7]。同樣地，對(duì)鼻咽癌、肝癌患者的研究顯示，低表達(dá)Kiss-1的患者惡性程度更高，患者的預(yù)后明顯落后于高表達(dá)Kiss-1的患者，而Kiss-1表達(dá)水平高的腫瘤患者，腫瘤發(fā)展慢，預(yù)后相對(duì)較好[8]。國(guó)內(nèi)外亦不乏學(xué)者對(duì)Kiss-1基因與結(jié)腸癌組織進(jìn)行研究。Liang等[9]通過(guò)免疫組織化學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，Kiss-1基因與結(jié)腸癌的分級(jí)、分期、腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定的關(guān)聯(lián)性，提出Kiss-1對(duì)診斷結(jié)腸癌、判斷其預(yù)后具有重要的潛在意義。本研究通過(guò)構(gòu)建pEGFP-N1-Kiss-1重組質(zhì)粒，成功將Kiss-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞。CCK8實(shí)驗(yàn)證實(shí)SW480細(xì)胞的體外增殖能力從細(xì)胞周期的48h開(kāi)始顯著下降，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度較陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組明顯減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，推測(cè)Kiss-1基因能有效抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖能力，從而影響結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

腫瘤的發(fā)生是多種基因共同作用的多步驟、多階段的過(guò)程，很多研究結(jié)果顯示Kiss-1基因的表達(dá)與多種腫瘤的增殖、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，然而其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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