鄒渭洪，付成效，秦旭平

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，湖南 衡陽 421001；2.南華大學(xué)藥物藥理研究所)

結(jié)直腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均位于全部腫瘤的第三位，國內(nèi)結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率分別位于全國城市腫瘤的第二位和第四位。遺傳因素、膳食結(jié)構(gòu)的變化、肥胖人群的顯著增多、惡劣的環(huán)境條件以及人口的老齡化等是結(jié)直腸癌發(fā)病相關(guān)的多種危險(xiǎn)因素。炎癥和免疫細(xì)胞在消化道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，但是作用機(jī)制仍不清楚[1-2]。文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)源性組胺缺失促進(jìn)小鼠骨髓和脾臟內(nèi)CD11b+Gr-1+不成熟髓系細(xì)胞的增殖和動員，促進(jìn)小鼠結(jié)腸癌的發(fā)生[3]。但是，組胺調(diào)控不成熟髓系細(xì)胞增殖、動員和分化，參與腸癌發(fā)生的機(jī)制是否與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子4(transducer and activator of transcription 4,STAT4)有關(guān)，尚缺乏證據(jù)。因此，本研究建立STAT4基因敲除(STAT4-/-)小鼠腸癌模型，探索STAT4信號通路在髓系細(xì)胞增殖、動員和炎癥相關(guān)腸癌中的作用，為腫瘤發(fā)病機(jī)制和防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

雄性STAT4-/-小鼠和野生型(WT)BaL b/c小鼠每組各20只，8～10周齡，購于南京大學(xué)模式動物研究所。

1.2 主要儀器與試劑

氧化偶氮甲烷(Azoxymethane,AOM，Sigma公司)；硫酸葡聚糖(Dextran Sulfate Sodium,DSS,分子量為36KD～50KD，MP,Biomedicals,CAT.160110)。熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；FACScan流式細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

1.3 方法

1.3.1 小鼠結(jié)腸癌模型的建立 氧化偶氮甲烷(Azoxymethane，AOM)是一種特異的引起腸道上皮細(xì)胞基因突變的化學(xué)試劑，硫酸葡聚糖(DSS)可以引起小鼠的急性潰瘍性結(jié)腸炎[4]。8～10周齡的雄性STAT4-/-小鼠和WT小鼠，每組各20只。實(shí)驗(yàn)組STAT4-/-和WT小鼠(各10只)首先腹腔注射一次AOM(12 mg/kg體重)，在AOM注射后一周，給予含3％DSS的飲用水，7天后更換為正常飲用水。對照組STAT4-/-和WT小鼠(各10只)給予一次200 μL PBS腹腔注射，飲用水為消毒純凈水。然后，分別在AOM+DSS處理后早期(10周)和晚期(20～24周)檢測小鼠腸道中腫瘤的數(shù)目和大小(腫瘤直徑≥3 mm為大腫瘤，<3 mm為小腫瘤)。腸癌病變組織HE染色后的進(jìn)行病理分析，包括結(jié)腸腫瘤的病理分型和炎性細(xì)胞浸潤評分。

1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)(FACS)分析免疫細(xì)胞亞群 麻醉處死小鼠，收集外周抗凝血、脾臟和骨髓細(xì)胞。方法簡述如下：抽取外周血約800 μL，抗凝處理，采用紅細(xì)胞裂解液(RBC Lysis Buffer,BD)裂解紅細(xì)胞備用；脾臟組織剪取小塊(黃豆大小)，在存在BD的40 μm濾網(wǎng)上研磨后，PBS沖洗收集；隨后分離股骨，采用含2％胎牛血清的PBS沖洗骨髓腔，經(jīng)40 μm濾網(wǎng)過濾收集洗脫液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后(1×106cell/100 μL)，分別加入CD11b、Gr-1、Ly6C、Ly6G等熒光標(biāo)記抗體(BD Bioscience公司)。FACS檢測骨髓、脾臟和外周血CD11b+Gr-1+MDSCs、單核系(CD11b+Ly6C+)的百分比變化，進(jìn)行固有免疫細(xì)胞動員分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，每組樣本數(shù)(n)為5，統(tǒng)計(jì)分析采用應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠結(jié)腸癌模型的建立和STAT4基因缺失對腸癌發(fā)生的影響

STAT4-/-和WT組小鼠在早期和晚期的腸道病變?nèi)鐖D1所示，在AOM和DSS共同處理10周(早期)，STAT4-/-小鼠可以在結(jié)腸的中下段和肛門處發(fā)現(xiàn)直徑在1～2 mm的腸瘤樣病變(或腸上皮異常增生)，而對照的WT小鼠只能發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸的中下段和肛門處有炎性病變和上皮組織增生。在20周(晚期)，STAT4-/-小鼠可以在結(jié)腸的中下段和肛門處發(fā)現(xiàn)直徑在3～5 mm的大型腸瘤樣病變，較對照組WT小鼠的腫瘤數(shù)量和大小均明顯增多。對腫瘤組織的病理分析顯示(圖2)，STAT4-/-小鼠的腸瘤的上皮組織分化程度較低，腸道上皮特有的杯狀細(xì)胞(goblet cell)較WT小鼠的腸瘤組織明顯減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，STAT4基因缺失，可以顯著增強(qiáng)STAT4-/-小鼠對AOM和DSS誘導(dǎo)腸癌發(fā)生的敏感性和促進(jìn)腫瘤生長。

2.2 STAT4基因缺失增強(qiáng)損傷組織的炎癥反應(yīng)

為了研究STAT4信號通路在DSS引起的潰瘍性腸炎中的作用，我們檢測了小鼠引用DSS水7天后腸道的早期炎癥反應(yīng)。小鼠出現(xiàn)體重減輕、腹瀉、血便等急性腸炎的表現(xiàn)。如圖3病理學(xué)切片HE染色發(fā)現(xiàn)所示，STAT4-/-小鼠的結(jié)腸中下段上皮水腫，小鼠病變結(jié)腸上皮組織腺體結(jié)構(gòu)紊亂，黏膜和黏膜下有大量單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤。這提示STAT4缺失不僅促進(jìn)固有免疫細(xì)胞的動員和分化，而且可以促進(jìn)免疫細(xì)胞對腸道損傷組織的浸潤，加重炎癥反應(yīng)。

圖1 大體解陪顯示STAT4基因缺失促進(jìn)結(jié)腸腫瘤的發(fā)生和發(fā)展

圖2 HE組化染色顯示瘤變組織中作為上皮分化標(biāo)識的杯狀細(xì)胞(×200)

2.3 STAT4缺失促進(jìn)髓系抑制性細(xì)胞MDSCs的分化和動員

應(yīng)用髓系細(xì)胞標(biāo)識CD11b和中性粒細(xì)胞標(biāo)識Gr-1+鑒別髓系免疫細(xì)胞。如圖4流式分析結(jié)果所示，CD11b+Gr-1+MDSCs在STAT4-/-小鼠的外周血較對照組WT小鼠顯著增加(外周血6.8±2.1％ vs 2.2±0.3％，P<0.05)。脾臟和骨髓內(nèi)的百分比較WT小鼠均增加(脾臟3.2±1.1％ vs 2.6±0.5％；骨髓48±12％ vs 39±9.1％，P<0.05)。

3 討 論

腸癌的發(fā)生與反復(fù)遷延的腸道慢性炎癥(目前也常稱作非可控性炎癥)有密切關(guān)系，但是對于炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞在結(jié)腸腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制尚未完全闡明[5]。建立高效、穩(wěn)定的、與炎癥相關(guān)的小鼠腸癌實(shí)驗(yàn)動物模型，將為闡明炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞在腸道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中的作用及分子機(jī)制，為探索、開發(fā)抗腫瘤相關(guān)藥物，提供高效的研究分析平臺。氧化偶氮甲烷(AOM)是一種特異的引起腸道上皮細(xì)胞基因突變的化學(xué)試劑，其病變主要發(fā)生在結(jié)腸。硫酸葡聚糖(DSS)可以引起小鼠的潰瘍性結(jié)腸炎。已有研究表明，不同分子量的DSS所誘導(dǎo)的腸炎病變特征不同，如分別用5KD,40KD和500KD分子量的DSS喂養(yǎng)小鼠，結(jié)果典型結(jié)腸炎病變只出現(xiàn)于5KD組和40KD組，50KD組的病變主要見于盲腸和上段結(jié)腸。DSS結(jié)腸炎的嚴(yán)重度并不完全依賴于DSS攝入總量，而主要是由DSS濃度決定[4]。在本研究中，我們應(yīng)用AOM和DSS處理STAT4-/-小鼠，建立了高效、敏感的炎癥相關(guān)小鼠結(jié)腸癌模型。此外，我們在預(yù)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)小鼠不同種屬對于DSS的敏感度不一，Balb/c小鼠較C57/B6小鼠對AOM和DSS刺激更敏感，成瘤率更高。

STAT分子家族是一類有著共同重要功能特點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄因子，其分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有：一個N基末端的STAT二聚化結(jié)構(gòu)域、一個DNA結(jié)合域、一個Src同源結(jié)構(gòu)域(SH2)、一個保守的酪氨酸殘基和一個C基末端的反式激活結(jié)構(gòu)域[6-7]。目前已經(jīng)被證實(shí)的STAT家族成員有7個，分別是STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6。研究發(fā)現(xiàn)STAT4是T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和巨噬/枯否細(xì)胞等免疫調(diào)控細(xì)胞內(nèi)IL-12/STAT4/IFN-γ信號傳導(dǎo)途徑的關(guān)鍵組成元件，是IL-12誘導(dǎo)免疫調(diào)控細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的關(guān)鍵調(diào)控因子[7]。在STAT4-/-小鼠，IL-12誘發(fā)的所有主要的T細(xì)胞和NK細(xì)胞功能反應(yīng)均明顯減弱，其中包括IFN-γ產(chǎn)生減少與Th1型反應(yīng)減弱，而STAT4的這一作用有可能是通過p38MAPK途徑介導(dǎo)的[8]。但是當(dāng)前對STAT家族在固有免疫細(xì)胞增殖和分化中的作用及分子機(jī)制研究尚有待加強(qiáng)和深入。

圖3 HE組化染色顯示STAT4基因缺失促進(jìn)大量免疫細(xì)胞浸潤炎癥組織(×200)

圖4 流式細(xì)胞分析檢測CD11b+Gr-1+MDSCs在外周血、脾臟和骨髓的表達(dá)(FACS代表圖)

髓系抑制性細(xì)胞MDSCs(小鼠的常用細(xì)胞標(biāo)識為CD11b+Gr-1+，而人的CD14+CD33+CD11b+)是來源于骨髓的一大類異構(gòu)細(xì)胞的總稱，包括單核系、粒系細(xì)胞和髓系前體細(xì)胞，具備向中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞或者樹突狀細(xì)胞分化的能力[9]。CD11b+Gr-1+MDSCs在急慢性感染、自身免疫疾病和腫瘤發(fā)生中發(fā)揮了重要作用[10]。我們的研究進(jìn)一步揭示STAT4在CD11b+Gr-1+MDSCs有較高水平的表達(dá)；STAT4缺失促進(jìn)MDSCs的增殖和動員，增強(qiáng)由DSS引起的腸道炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)[3]，小鼠骨髓和脾臟有大量的CD11b+Gr-1+不成熟髓系細(xì)胞(immature myeloid cells,IMCs)，與MDSCs具有一樣的細(xì)胞表面識別標(biāo)識。這些不成熟髓系細(xì)胞與炎癥相關(guān)的小鼠結(jié)腸癌和皮膚癌的發(fā)展密切相關(guān)，其向巨噬細(xì)胞的分化與內(nèi)源性組胺的表達(dá)有關(guān)[11-12]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在MDSCs的發(fā)育中，STAT/IRF-8軸扮演著重要的角色。我們研究證實(shí)STAT4缺失促進(jìn)腸癌的發(fā)展，與STAT4信號通路調(diào)節(jié)MDSCs的增殖、分化和動員有關(guān)。STAT4信號通路與組胺信號通路是否存在“對話”(cross talk)還有待更多的研究[13]。

綜上所述，本研究應(yīng)用STAT4基因敲除小鼠，通過AOM+DSS處理誘導(dǎo)建立了一種敏感的炎癥相關(guān)結(jié)腸癌實(shí)驗(yàn)動物模型，揭示了STAT4信號通路在CD11b+Gr-1+MDSCs增殖、分化和動員中的作用；STAT4缺失導(dǎo)致的信號阻抑顯著增強(qiáng)小鼠炎癥相關(guān)結(jié)腸腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。以STAT4信號通路及其上下游調(diào)控因子為靶標(biāo)，可能為結(jié)腸腫瘤的發(fā)生機(jī)制和藥物開發(fā)研究提供新的靶點(diǎn)。

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