劉小葉，周建斌，李 婷，黃余良

(南華大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖南 衡陽 421001)

宮頸癌是較為常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球80％的宮頸癌患者集中在發(fā)展中國家，國內(nèi)每年新增病例約11萬以上[1]，對(duì)宮頸癌發(fā)病機(jī)制的研究越來越引起研究者的重視。環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)是前列腺素生物合成過程中重要的限速酶，COX-2是其中的一種亞型，生長因子，促炎癥細(xì)胞因子等的激活可以促進(jìn)COX-2的表達(dá)。大量的研究發(fā)現(xiàn)，COX-2存在于許多惡性腫瘤中，如結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌和宮頸癌等，可能通過影響腫瘤細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)腫瘤侵襲力，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移等機(jī)制與惡性腫瘤的不良預(yù)后及低生存率密切相關(guān)[2-3]。氮-2，環(huán)己氧-4，硝基苯-甲基磺胺(NS398)是COX2的特異性抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)它可抑制腫瘤的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，但其具體機(jī)制尚不清楚。Akt1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，又稱為蛋白激酶B(protein kinase,PKB)?；罨腁kt1可以抑制細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)細(xì)胞周期運(yùn)行，促進(jìn)細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。本研究以人宮頸癌細(xì)胞株(Hela細(xì)胞)為研究對(duì)象，觀察NS398對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用及Akt1蛋白表達(dá)的變化，并采用Akt1激動(dòng)劑活化Akt1，進(jìn)一步探討Akt1在NS398抑制Hela細(xì)胞增殖過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

NS398購自美國Sigma公司，溶解在100％二甲基亞砜(DMSO)溶劑中，配成100 mmol/L的液體，實(shí)驗(yàn)時(shí)稀釋至不同濃度。IGF-1購自澳大利亞GroPep公司，磷酸化Akt1單克隆抗體(即p-Akt，為Ser473位點(diǎn)磷酸化)購自美國Cell Signaling Technology公司，Western blotting免疫印跡所用二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司，BCA蛋白檢測試劑盒購自Hyclone公司，噻唑藍(lán)(MTT)比色法試劑盒、麗春紅染色劑及其它檢測試劑盒均為國產(chǎn)試劑。

1.2 細(xì)胞株及培養(yǎng)條件

人宮頸癌細(xì)胞株(Hela細(xì)胞)購自中科院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。細(xì)胞貼壁生長于含雙抗(青霉素和鏈霉素)及10％小牛血清的DMEM中，置37 ℃、5％的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以0.25％胰酶和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)1∶1(V/V)混合的消化液進(jìn)行傳代換液，各組實(shí)驗(yàn)分別取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行。

細(xì)胞在給NS398和IGF-1前無血清培養(yǎng)基饑餓過夜，使細(xì)胞處于相同增殖狀態(tài)。NS398用DMSO配制成50mmol/L的貯存液(使用時(shí)培養(yǎng)液中DMSO濃度不超過0.1％)，-80°C保存，使用時(shí)用無血清培養(yǎng)基稀釋成所需要的工作濃度。

1.3 MTT比色法檢測細(xì)胞的生長

取對(duì)數(shù)生長期的培養(yǎng)細(xì)胞，傳代并接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，以無血清培養(yǎng)液處理24 h，然后換含不同處理因素的培養(yǎng)液分別分組處理細(xì)胞，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)相應(yīng)的時(shí)間后，加入新鮮配制的MTT，再繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜(DMSO)，10 min后在全自動(dòng)酶標(biāo)儀上測定570 nm處吸光度(A值)，以A570 nm值代表細(xì)胞活力。細(xì)胞生長抑制率(IR)按如下公式計(jì)算：生長抑制率(％)=(對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100％。

1.4 Western blotting免疫印跡檢測蛋白質(zhì)的表達(dá)

采用懸浮緩沖液裂解細(xì)胞，常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)BCA法蛋白定量后，各組分別取。50 μg蛋白進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜后用麗春紅染色檢測轉(zhuǎn)膜效果，再用10％脫脂奶粉封閉PVDF膜，然后依次孵育一抗(4 ℃孵育過夜)、TBST液洗滌(三次，共15 min)、二抗(室溫孵育1 h)，經(jīng)TBST液洗滌(三次，共15 min)后，以Western免疫熒光檢測試劑盒激發(fā)熒光，于暗室中顯示于X光片，結(jié)果用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片掃描進(jìn)行相對(duì)灰度分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 環(huán)氧合酶抑制劑NS398對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響

為了解NS398對(duì)Hela細(xì)胞增殖的影響，采用MTT法檢測細(xì)胞的吸光度，計(jì)算IR值后顯示，不同濃度(0、50、100、150、200 μmol/L)NS398分別處理細(xì)胞0，12，24，36，48 h后，細(xì)胞代謝MTT的能力明顯降低，IR值逐漸上升，這表明NS398可明顯抑制Hela細(xì)胞的生長，并且其抑制作用呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性(P<0.05)(圖1)。

圖1 MTT法分析不同濃度的NS398對(duì)Hela細(xì)胞生長抑制率的影響

2.2 環(huán)氧合酶抑制劑NS398對(duì)Hela細(xì)胞p-Akt1蛋白表達(dá)的影響

為觀察環(huán)氧合酶抑制劑NS398對(duì)Hela細(xì)胞p-Akt1蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，采用不同濃度(0、50、100、150、200 μmol/L)NS398處理Hela細(xì)胞24 h后，以Western blotting免疫印跡法檢測p-Akt1蛋白質(zhì)的表達(dá)，結(jié)果顯示，隨著NS398濃度的增加，細(xì)胞中p-Akt1蛋白的表達(dá)逐漸下調(diào)，其效應(yīng)呈濃度依賴性(P<0.05)(圖2)。

圖2 不同濃度NS398處理Hela細(xì)胞24h后p-Akt1蛋白質(zhì)表達(dá)的變化

此外，為觀察環(huán)氧合酶抑制劑NS398對(duì)Hela細(xì)胞p-Akt1蛋白質(zhì)表達(dá)的影響的時(shí)效性，采用150 μmol/L的NS398處理Hela細(xì)胞不同時(shí)間(0，12，24，36，48 h)，以Western blotting免疫印跡法檢測p-Akt1蛋白質(zhì)的表達(dá)，結(jié)果顯示，隨著NS398處理時(shí)間的增加，細(xì)胞中p-Akt1蛋白的表達(dá)逐漸下調(diào)，其效應(yīng)呈時(shí)間依賴性(P<0.05)(圖3)。

圖3 NS398(150 μmol/L)處理Hela細(xì)胞不同時(shí)間后p-Akt1蛋白表達(dá)的變化

2.3 Akt1激動(dòng)劑IGF-1在NS398抑制Hela細(xì)胞增殖過程中的作用

為進(jìn)一步探討Akt1在環(huán)氧合酶抑制劑NS398影響Hela細(xì)胞增殖過程中的作用，在150 μmol/L NS398處理細(xì)胞的基礎(chǔ)上，同時(shí)結(jié)合不同濃度的Akt1激動(dòng)劑IGF-1(50，100，150 ng/ml)處理Hela細(xì)胞0，12，24，36，48 h，經(jīng)MMT法檢測細(xì)胞的吸光度并計(jì)算IR值后顯示，Akt1激動(dòng)劑處理后，Hela細(xì)胞代謝MTT的能力明顯增強(qiáng)，其IR值逐漸下降，這表明Akt1活性增強(qiáng)可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)NS398對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用，并且其作用呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性(P<0.05)(圖4)。

圖4 不同濃度IGF-1對(duì)NS398(150 μmol/L)作用下的Hela細(xì)胞生長抑制率的影響

3 討 論

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居女性生殖道腫瘤的首位，近年來其發(fā)病率有逐年上升和發(fā)病年輕化的趨勢[5]，但目前宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡述清楚。NS398是環(huán)氧合酶-2(Cycolooxygenase 2,COX-2)的選擇性抑制劑，屬磺胺類制劑的衍生物，是非甾體類抗炎藥物之一[6]。近年來，大量的研究表明NS398除特異性地抑制COX-2的表達(dá)之外，還可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，NS398可呈濃度依賴性抑制舌鱗癌細(xì)胞株Tca8113細(xì)胞中MMP2的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[9]。鄒明英等[5]研究發(fā)現(xiàn)，NS398抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖及MMP2的表達(dá)。這些研究說明NS398可以抑制宮頸癌的發(fā)展，但其具體分子機(jī)制尚未研究清楚。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，NS398可呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性抑制Hela細(xì)胞的增殖。

Akt1在組織中分布廣泛，是Akt的亞型之一，也是PI3K/Akt通路下游的主要作用靶點(diǎn)。它作為細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的中樞環(huán)節(jié)，對(duì)細(xì)胞增殖、分化及存活等多種生物學(xué)業(yè)過程起重要的調(diào)節(jié)作用，參與調(diào)節(jié)腫瘤、糖尿病、炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，Akt可磷酸化Caspase-9前體，抑制細(xì)胞凋亡[10]；上調(diào)抑癌基因c-Myc的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞的增殖[11]；Akt穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株能誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換且E-鈣黏素表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞黏附性降低，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，從而在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[12]。此外，國內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)，磷酸化Akt(p-Akt)特異性過表達(dá)于子宮內(nèi)膜樣癌中，與其侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[13]。

本研究采用環(huán)氧合酶抑制劑NS398處理宮頸癌Hela細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)p-Akt1蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào)，并且NS398的作用效應(yīng)呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性，這提示NS398抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的作用可能與p-Akt1表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。為明確Akt1在其中的作用，我們采用了不同濃度的Akt1激動(dòng)劑IGF-1與NS398共同處理Hela細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Akt1激動(dòng)劑可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)NS398對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用，并且其作用效應(yīng)也呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性。本實(shí)驗(yàn)表明，Akt1參與了NS398抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的作用，NS398可能是通過抑制Akt1的表達(dá)而影響Hela細(xì)胞的增殖。

總之，本研究證實(shí)了p-Akt1表達(dá)的變化能影響NS398對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用，表明Akt1與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展有著較為密切的關(guān)系，可能是環(huán)氧合酶-2抑制劑抗宮頸癌的可能作用機(jī)制之一。

[1]肖和龍,琚雄飛,馬劍玲,等.惠州市成年女性HPV感染及其基因型分布[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志,2013,41(4):361-364.

[2]Kargi A,Uysal M,Bozcuk H,et al.The importance of COX-2 expression as prognostic factor in early breast cancer [J].JBUON,2013,18(3):579-584.

[3]Schildberg C,Abbas M,Merkel S,et al.COX-2,TFF1,and Src define better prognosis in young patients with gastric cancer [J].J Surg Oncol,2013,108(6):409-413.

[4]Cariaga-Martinez AE,Lopez-Ruiz P,Nombela-Blanco MP,et al.Distinct and specific roles of Akt1 and AKT2 in androgen-sensitive and androgen-independent prostate cancer cells [J].Cell Signal,2013,25(7):1586-1597.

[5]鄒明英,周菊香,曾希,等.NS398抑制宮頸癌Hela細(xì)胞增殖及MMP2的表達(dá)[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,13(25):4940-4943.

[6]Qiu R,Chen J,Sima J,et al.NS398 induces apoptosis in non-small cell lung cancer cells [J].J Cancer Res Clin Oncol,2012,138(1):119-124.

[7]Lee SJ,Hwang JW,Yim H,et al.Synergistic effect of simvastatin plus NS398 on inhibition of proliferation and survival in hepatocellular carcinoma cell line [J].J Gastroenterol Hepatol,2014,29(6):1299-1307.

[8]胡孫寬,周琴,林鐵素,等.選擇性環(huán)氧化酶2抑制劑NS-398對(duì)胃癌細(xì)胞AGS增殖的抑制作用[J].中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2013,27(1):72-76.

[9]佘先麟,郝艷梅,司晨晨,等.NS-398對(duì)舌鱗癌基質(zhì)金屬蛋白酶2蛋白表達(dá)的影響[J].江蘇醫(yī)藥,2012,38(2):140-141.

[10]Quan JH,Cha GH,Zhou W,et al.Involvement of PI 3 kinase/Akt-dependent Bad phosphorylation in Toxoplasma gondii-mediated inhibition of host cell apoptosis [J].Exp Parasitol,2013,133(4):462-471.

[11]Radke J,Bortolussi G,Pagenstecher A.Akt and c-Myc induce stem-cell markers in mature primary p53(-)/(-) astrocytes and render these cells gliomagenic in the brain of immunocompetent mice [J].PloS One,2013,8(2):e56691.

[12]Fenouille N,Tichet M,Dufies M,et al.The epithelial-mesenchymal transition (EMT) regulatory factor SLUG (SNAI2) is a downstream target of SPARC and AKT in promoting melanoma cell invasion [J].PloS One,2012,7(7):e40378.

[13]陳紅霞,尹春華,陶雪勤.子宮內(nèi)膜樣癌組織中p-Akt表達(dá)變化及意義[J].山東醫(yī)藥,2013,53(32):40-43.