張麗霞，王 倩，陳 金，盧 葳，蔡 震

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院a.皮膚病性病研究所，b.整形外科，四川 成都610072)

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis，AD)作為一種慢性復(fù)發(fā)性、瘙癢性、炎癥性皮膚病，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，是常見的難治性皮膚病之一，嚴(yán)重影響患者及其家屬的生活質(zhì)量。隨著人們對(duì)AD 研究的不斷深入，動(dòng)物模型逐漸成為研究AD 的發(fā)病機(jī)理及探索其治療手段的不可缺少的工具，故AD 動(dòng)物模型的開發(fā)和確立，對(duì)研究其發(fā)病機(jī)制和治療具有重要意義。2011 年9 月至2012 年3 月我們通過外用2，4-二硝基氟苯(DNFB)丙酮/橄欖油溶液致敏與激發(fā)BALB/c 小鼠，探索AD 模型的建立方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 6 ～8 w 的SPF 級(jí)純系雌性BALB/c 小鼠16 只，體重約為22 g，由四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，并由該中心工作人員飼養(yǎng)，房間環(huán)境控制在溫度23 ～25 ℃，相對(duì)濕度50% ～60%，晝夜時(shí)間控制在各12 h。2，4-二硝基氟苯(DNFB)購于Sigma 公司。小鼠IL-4、IFN-γ 及IgE ELISA 檢測試劑盒購于上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司(進(jìn)口分裝)。

1.2 AD 模型的建立 將16 只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組8 只。皮損誘導(dǎo)參考Wu 等［1］的AD 小鼠模型的建立方法略有改進(jìn):實(shí)驗(yàn)前1 周用8%硫化鈉淀粉溶液脫去兩組小鼠背部體毛，面積約2.5 cm×2.5 cm。實(shí)驗(yàn)第1 天和第2 天模型組小鼠皮損致敏與激發(fā)用0.5%DNFB 以及丙酮/橄欖油(3︰1)混合溶液各涂搽一次小鼠背部脫毛區(qū)，每次100 μl，第3 ～6 天不作處理，第7 天始每隔2 天涂搽一次，每次70 μl，第28 天涂搽后造模完成，共涂搽10 次。對(duì)照組小鼠背部脫毛區(qū)僅涂搽丙酮/橄欖油(3︰1)溶液，涂搽時(shí)間及涂搽劑量與模型組一致。

1.3 觀察指標(biāo) ①搔抓行為:建模完成后，將小鼠單獨(dú)放置，觀察10 min 內(nèi)小鼠搔抓背部次數(shù)，連續(xù)搔抓算作一次。②皮損表現(xiàn):觀察各組小鼠皮損表現(xiàn)情況并拍照。③血清IL-4、IFN-γ 及IgE 濃度檢測:模型建立成功后，模型組及對(duì)照組小鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛(1 ml/kg)麻醉后，摘除右側(cè)眼球取血，37 ℃靜置30 min，3500 r/min 離心15 min，收集血清，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，使用小鼠IL-4、IFN-γ 及IgE ELISAKit，按照說明書指示操作。④組織病理檢查:無菌條件下取兩組小鼠皮損組織，以10%甲醛液固定。常規(guī)石蠟包埋、切片，用蘇木精-伊紅染色后，顯微鏡下觀察組織病理改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，比較用t檢驗(yàn)，按照檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 搔抓行為 模型組小鼠10 分鐘內(nèi)搔抓行為次數(shù)(12.63±2.2)次，對(duì)照組(1.25±1.04)次，模型組小鼠10 分鐘內(nèi)搔抓行為次數(shù)顯著高于對(duì)照組(t=13.234，P＜0.05)。

2.2 局部皮膚表現(xiàn)及皮膚組織病理變化 對(duì)照組小鼠皮膚表現(xiàn)正常，組織結(jié)構(gòu)基本正常，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤;模型組小鼠皮膚可見紅斑、丘疹、結(jié)痂、苔蘚樣變等皮損改變，鏡下可見角化過度伴角化不全，棘層肥厚，棘細(xì)胞間海綿水腫，真皮淺層可見以淋巴細(xì)胞為主的慢性炎細(xì)胞浸潤(圖1、圖2)。

圖1 兩組局部皮膚表現(xiàn) a:模型組;b:對(duì)照組圖2 兩組皮膚組織病理變化(HE 染色，×100) a:模型組;b:對(duì)照組

2.3 血清IL-4、IFN-γ 及IgE 濃度 模型組小鼠血清IL-4、IFN-γ 及IgE 水平均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，見表1。

表1 模型組和對(duì)照組IL-4、IFN-γ 及IgE 血清表達(dá)水平比較

3 討論

AD 是一個(gè)由Th1/Th2 免疫反應(yīng)引發(fā)的雙相性炎癥性皮膚?。?］。Thl/Th2 細(xì)胞通過分泌不同的細(xì)胞因子而發(fā)揮免疫作用，Th1 細(xì)胞亞群主要產(chǎn)生IL-2、INF-γ 等細(xì)胞因子，Th2 細(xì)胞亞群則主要產(chǎn)生IL-4、IL-13 等細(xì)胞因子［3］。在AD 急性期的皮損及循環(huán)血液中均可呈現(xiàn)IL-4、IL-13 等細(xì)胞因子表達(dá)增高和IFN-γ 表達(dá)降低，Th2 細(xì)胞占優(yōu)勢。在AD 慢性期，雖然皮損及循環(huán)血液中的細(xì)胞因子IL-4、IL-13的水平也高，但較急性期則明顯降低，而此期IFN-γ水平明顯增高，Th1 細(xì)胞占優(yōu)勢［4］。

建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是我們研究人類各種疾病發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，探索新的治療途徑不可缺少的工具及重要的手段，能避免給患者帶來損害及痛苦，并可克服不便于在患者身上試驗(yàn)的各種人類相關(guān)疾病的研究，還可以用單一的病因，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出典型的疾病模型，克服了人類疾病發(fā)生發(fā)展緩慢、潛伏期長、發(fā)病原因多樣及伴有其它各種疾病等因素的干擾。

有關(guān)AD 模型的動(dòng)物選擇方面，1997 年Matsuda等［5］將NC/Nga 鼠作為首個(gè)AD 模型鼠作了報(bào)告。該小鼠模型與人類AD 的各個(gè)方面都極其相似，是公認(rèn)的能夠較全面反映AD 疾病發(fā)展的動(dòng)物模型，多用于AD 的病理生理方面的研究［6］，但此種小鼠來源困難且價(jià)格昂貴。近幾年，人類又建立了一系列AD 的轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠模型，其對(duì)AD 的發(fā)病機(jī)制，特別是一些細(xì)胞因子的作用有了更深一步的認(rèn)識(shí)［7］。雖然國際上轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)已相當(dāng)成熟，但國內(nèi)此項(xiàng)技術(shù)才剛起步，還停留在實(shí)驗(yàn)室摸索階段，沒有形成產(chǎn)業(yè)化，此種小鼠來源也相當(dāng)困難。近年來，在AD 模型的建立中，BALB/c 小鼠得到了廣泛使用，BALB/c 小鼠是一個(gè)常用的近交系(inbred strain)小鼠品系，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所于1985 年從美國NIH 引進(jìn)。BALB/c小鼠個(gè)體之間差異小，遺傳基因純，整體素質(zhì)好，常用于單克隆抗體和免疫學(xué)研究。早在1995 年，Kitagaki 等［8］用1%DNFB 反復(fù)涂擦BALB/c 鼠耳部皮膚24 ～48 d 后，發(fā)現(xiàn)真皮大量肥大細(xì)胞和CD4+T 淋巴細(xì)胞浸潤，血清特異性IgE 顯著升高，和AD 患者及其他AD 動(dòng)物模型相似。之后Spergel 等［9］用卵清蛋白(OVA)制成斑貼致敏無菌條件下的BALB/c小鼠，引發(fā)了系統(tǒng)免疫反應(yīng)和局部皮炎表現(xiàn)，其皮損表現(xiàn)及病理結(jié)果與AD 表現(xiàn)一致。

DNFB 丙酮液是一種常見的致敏劑，可致敏和激發(fā)動(dòng)物皮膚出現(xiàn)典型的接觸性皮炎損害，在制作實(shí)驗(yàn)性接觸性皮炎動(dòng)物模型中被廣泛應(yīng)用［10，11］，因此本研究應(yīng)用DNFB 作為致敏劑反復(fù)刺激來制備BALB/c 小鼠模型。通過觀察小鼠皮膚變化及其搔抓行為，評(píng)價(jià)炎性程度，并檢驗(yàn)外周血內(nèi)IL-4、IFN-γ及IgE 的含量來判斷模型是否制作成功。本實(shí)驗(yàn)中我們第一次應(yīng)用DNFB 刺激小鼠除毛的背部后1 周內(nèi)，局部皮膚未出現(xiàn)任何炎性反應(yīng)，說明DNFB 對(duì)皮膚沒有直接損傷。重復(fù)外用DNFB4周，可以引起B(yǎng)ALB/c 小鼠明顯的濕疹樣改變，背部出現(xiàn)紅斑、丘疹、滲出、結(jié)痂等表現(xiàn);組織HE 染色顯示鏡下可見角化過度伴角化不全、棘層肥厚、棘細(xì)胞間海綿水腫，真皮淺層可見以淋巴細(xì)胞為主的慢性炎細(xì)胞浸潤;上調(diào)血漿中IL-4、IFN-γ 及IgE 的濃度，同時(shí)伴有搔抓行為的增加。以上結(jié)果顯示采用半抗原DNFB誘導(dǎo)與激發(fā)BALB/c 小鼠，模型組小鼠搔抓頻率、皮損表現(xiàn)、組織病理學(xué)結(jié)果和細(xì)胞因子變化都與人類慢性期AD 類似［12］，提示我們AD 慢性期小鼠模型建立成功，此模型為我們進(jìn)一步研究AD 的發(fā)病機(jī)理及探索其治療手段提供了有效實(shí)驗(yàn)工具。

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