王建清， 徐麗紅， 張 玉， 王 偉， 胡 棋

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州 310021）

魯米諾化學(xué)發(fā)光法測(cè)定食品中的亞硫酸鹽

王建清， 徐麗紅*， 張 玉， 王 偉， 胡 棋

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州 310021）

提出了運(yùn)用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定食品中亞硫酸鹽的新方法，對(duì)影響化學(xué)發(fā)光的諸因素進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)和探討，得出較佳檢測(cè)條件：方法的定量限為4.6mg/kg，亞硫酸鹽質(zhì)量濃度在1.0～10.0mg/ L與發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)值（ΔI）呈良好的線性關(guān)系，R2為0.993 4.對(duì)6類樣品進(jìn)行了測(cè)定并做加標(biāo)回收試驗(yàn)，平均RSD 3.05%，平均回收率93.0%，可用于食品中亞硫酸鹽的定量與定性檢測(cè).

魯米諾試劑；亞硫酸鹽；化學(xué)發(fā)光

食品中亞硫酸鹽殘留指標(biāo)是國(guó)家質(zhì)檢部門的嚴(yán)控指標(biāo)之一.在食品加工過(guò)程中，人為或非人為的因素都會(huì)導(dǎo)致諸多食品中亞硫酸鹽的含量超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，如何控制亞硫酸鹽含量是各食品生產(chǎn)加工企業(yè)和質(zhì)檢機(jī)構(gòu)面臨的一大難題.為了解決食品中亞硫酸鹽殘留超標(biāo)問(wèn)題，各食品生產(chǎn)企業(yè)和質(zhì)量監(jiān)督部門都必需對(duì)食品中的亞硫酸鹽進(jìn)行檢測(cè).目前對(duì)食品中亞硫酸鹽的檢測(cè)主要有國(guó)標(biāo) GB/T 5009.34—2003［1］中規(guī)定的鹽酸副玫瑰苯胺比色法，其主要原理是利用亞硫酸鹽與四氯汞鈉的反應(yīng)生成穩(wěn)定的絡(luò)合物，再與甲醛及鹽酸副玫瑰苯胺作用生成紫紅色絡(luò)合物，在波長(zhǎng)550 nm處測(cè)定溶液吸光度，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，方法十分完善可靠，靈敏度符合要求，其不足之處是操作繁雜，耗時(shí).測(cè)定亞硫酸鹽的其他方法有電導(dǎo)滴定法［2］、離子色譜法［3］、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法［4］、氣相色譜法［5］、近紅外光譜法［6］等，這些方法在某些領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用［7-18］.魯米諾（Luminol，3-氨基苯二甲酰肼）是人們公認(rèn)的最有效的化學(xué)發(fā)光物質(zhì)之一，在堿性介質(zhì)中，亞硫酸鹽能夠有效增強(qiáng)魯米諾-過(guò)氧化氫體系的化學(xué)發(fā)光，且在一定的濃度范圍內(nèi)，與化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度呈良好的線性關(guān)系，可應(yīng)用于亞硫酸鹽的檢測(cè).魯米諾化學(xué)發(fā)光法作為測(cè)定食品中亞硫酸鹽的方法具有快速簡(jiǎn)便、無(wú)需復(fù)雜精密儀器、靈敏度較高等特點(diǎn)，具有一定的應(yīng)用價(jià)值.

本文研究了魯米諾-過(guò)氧化氫體系與亞硫酸鹽的各種反應(yīng)條件，建立了一種快速、簡(jiǎn)便測(cè)定亞硫酸鹽殘留量的檢測(cè)方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與材料

BHP-9504型系列微孔板化學(xué)發(fā)光分析儀，北京濱松光子技術(shù)股份有限公司；96孔微孔板（黑板），美國(guó)康寧公司生產(chǎn)；分析天平（感量0.000 1 g，0.1 g）；超聲波儀；200μL移液槍.

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液及試劑的配制

Na2SO3標(biāo)準(zhǔn)溶液（100mg/L，以二氧化硫計(jì)）：稱取0.019 7 g Na2SO3用水溶解定容至100mL，冷藏保存.用時(shí)稀釋至需要濃度.

Luminol（Fluka公司）儲(chǔ)備液（1.0×10-2mol/L）：稱取0.442 9 g魯米諾，用0.1 mol/L NaOH溶解定容至250mL，避光保存；用時(shí)稀釋至需要濃度.

H2O2儲(chǔ)備液（1.0×10-3mol/L）：由13.0 mol/L 的H2O2直接稀釋而成，當(dāng)天配制.

Cu2+儲(chǔ)備液（1.0×10-2mol/L）：稱取0.2497 g CuSO4·5H2O，用二次水溶解定容至100m L，用時(shí)稀釋成所需濃度.

0.1mol/L NaOH溶液：稱取氫氧化鈉4.0 g，用水溶解并定容到1 L.

所用試劑均為分析純，水為二次蒸餾水.

1.3 樣品前處理

稱取1.0 g干燥粉碎后的樣品于100m L容量瓶中，加30mL水，1.0mL 0.1mol/L NaOH溶液，超聲15 min，然后用水定容，過(guò)濾后備用.

1.4 樣品檢測(cè)步驟

用200μL移液槍分別吸取40μL亞硫鹽酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液（1.0～10.0 mg/L）、1.0×10-3mol/L H2O2溶液和1.0×10-3mol/L Luminol試劑于96孔微孔板中（不要顛倒加樣順序），立即置入化學(xué)發(fā)光儀中，1 min后讀取發(fā)光值.同時(shí)讀取空白值（用水代替亞硫鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液），計(jì)算化學(xué)發(fā)光值差值ΔI.以亞硫鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與ΔI制作標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，同時(shí)讀取樣品ΔI，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算樣品中亞硫鹽酸含量（以二氧化硫計(jì)）.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 化學(xué)發(fā)光讀取時(shí)間曲線

亞硫酸鹽對(duì)Luminol-H2O2-Cu2+反應(yīng)體系的化學(xué)發(fā)光有很強(qiáng)增敏作用，Cu2+作為催化劑使Luminol試劑迅速?gòu)幕鶓B(tài)激發(fā)到激發(fā)態(tài)，并發(fā)出光能，發(fā)光從混合后開始為最大值隨即迅速衰減至基線，可見(jiàn)該體系為快速發(fā)光體系.用200μL移液槍分別吸取40μL 100mg/L亞硫鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、1.0×10-3mol/L H2O2溶液、1.0×10-2mol/L Cu2+儲(chǔ)備液和1.0×10-2mol/L Luminol試劑于96孔微孔板中，立即置入化學(xué)發(fā)光儀中，每間隔10秒測(cè)定一次化學(xué)發(fā)光值，繪出圖1（Luminol-H2O2-Cu2+反應(yīng)體系的發(fā)光時(shí)間曲線）.從圖1可見(jiàn)，發(fā)光值隨測(cè)定時(shí)間不斷變化，無(wú)法實(shí)現(xiàn)定量測(cè)定.可見(jiàn)Cu2+作為催化劑，具有較強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光體系增敏作用，且該體系極不穩(wěn)定.

2.2 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系及讀取時(shí)間的選擇

圖1 加Cu2+發(fā)光值讀取時(shí)間曲線Fig.1 Illumination values at different time points

按實(shí)驗(yàn)方法2.1，不加Cu2+，可降低反應(yīng)速度，有利于讀取穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光值，并每隔10秒測(cè)定一次發(fā)光值繪制圖2.從圖2得出，化學(xué)發(fā)光值從加樣始為最大，隨即迅速降低，至60秒后基本趨于穩(wěn)定.故選擇不加Cu2+且加樣后60秒為讀取化學(xué)發(fā)光值時(shí)間.

圖2 不加Cu2+發(fā)光讀取時(shí)間曲線Fig.2 Lightemitting values at different time points

2.3 魯米諾濃度的選擇

按實(shí)驗(yàn)方法2.1，不加 Cu2+，研究了不同濃度的魯米諾（1.0×10-4～1.5×10-3mol/L）對(duì)發(fā)光值的影響（見(jiàn)圖3）.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)魯米諾濃度增大，發(fā)光值逐步增加，到1.0×10-3mol/L時(shí)，達(dá)到最大值；濃度繼續(xù)增加，發(fā)光強(qiáng)度還會(huì)增加，但其重現(xiàn)會(huì)變差，因此實(shí)驗(yàn)選擇魯米諾濃度為1.0×10-3mol/L.

圖3 Luminol試劑濃度對(duì)發(fā)光值的影響Fig.3 Illumination values under different luminol reagent concentrations

2.4 過(guò)氧化氫濃度的選擇

按實(shí)驗(yàn)方法2.1，僅改變H2O2的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，當(dāng)H2O2的濃度在1.0×10-4～2.0×10-3mol/L內(nèi)變化時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度逐步增加，到1.0×10-3mol/L時(shí)基本達(dá)到最大值（見(jiàn)圖4），故選擇H2O2的濃度為1.0×10-3mol/L.

圖4 H2 O2試劑濃度對(duì)化學(xué)發(fā)光值的影響Fig.4 Chemiluminescence values under different H2 O2 reagent concentrations

2.5 提取超聲時(shí)間的選擇

按1.3實(shí)驗(yàn)前處理?xiàng)l件，選擇超聲時(shí)間為15，30，45，60，75，90 min，再按1.4實(shí)驗(yàn)方法并讀取化學(xué)發(fā)光值，制作提取時(shí)間與化學(xué)發(fā)光值曲線如圖5.從圖5可知，超聲時(shí)間對(duì)化學(xué)發(fā)光值變化不大，超聲15min已能提取樣品中的亞硫酸鹽，故選擇最短超聲時(shí)間為15min.

圖5 提取時(shí)間與化學(xué)發(fā)光值曲線Fig.5 Chemiluminescence values at differentthe extraction times

2.6 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

樣品提取選取堿性條件（加氫氧化鈉），用水超聲提取時(shí)間15 min，魯米諾濃度確定為1.0×10-3mol/L，過(guò)氧化氫濃度確定為1.0×10-3mol/L，所有試劑及樣品加入后60 s為儀器讀取發(fā)光值時(shí)間.

2.7 線性關(guān)系與方法檢出限、精密度2.6

按實(shí)驗(yàn)條件，以亞硫酸鹽的濃度與發(fā)光值ΔI繪工作曲線，見(jiàn)圖6.亞硫酸鹽濃度在1.0～10.0 mg/L時(shí)，化學(xué)發(fā)光值與亞硫酸鹽濃度呈良好的線性關(guān)系.其線性回歸方程為y=435.82x-37.647，相關(guān)系數(shù)R2為0.993 4.對(duì)香菇樣品平行測(cè)定10次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 3.59%.以標(biāo)準(zhǔn)曲線截距3倍計(jì)算最低檢出濃度，最低檢出質(zhì)量比為2.3mg/kg，定量限則為4.6mg/kg.

圖6 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Fig.6 Standard curve of sulfite concentration and luminous intensity

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定及回收率

取市售香菇、銀耳、腐竹、腰果仁、新竹米粉、開心果樣品若干，制樣后按方法2.6檢測(cè)（6次重復(fù)測(cè)定），測(cè)得樣品中亞硫鹽殘留量（平均值），并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，做加標(biāo)試驗(yàn)，測(cè)定加標(biāo)后測(cè)出量（2次重復(fù)測(cè)定），計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 樣品亞硫酸鹽測(cè)定結(jié)果及回收率Tab.1 Results of samples determination and sulfite recoveries

3 結(jié)果與討論

本文運(yùn)用近年來(lái)廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、藥物、食檢、環(huán)境和材料科學(xué)等領(lǐng)域的化學(xué)發(fā)光技術(shù)，建立了測(cè)定食品中亞硫酸鹽的一種簡(jiǎn)便方法.方法是對(duì)原有的流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法的改進(jìn)，取消了原先需要的流動(dòng)注射裝置，簡(jiǎn)化了儀器設(shè)備及操作程序，使其更加快速簡(jiǎn)便.方法的定量限為4.6 mg/kg，回收率93.0%，實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果相對(duì)相差10%以下，線性關(guān)系良好，R2為0.993 4，滿足檢測(cè)要求，樣品濃度更低的還可定性測(cè)定，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程在半小時(shí)以內(nèi).由于化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系較不穩(wěn)定，化學(xué)發(fā)光值會(huì)隨著時(shí)間迅速變化，檢測(cè)過(guò)程需注意的是化學(xué)發(fā)光值ΔI儀器讀取時(shí)間的一致性，以確保結(jié)果重現(xiàn).本法建議在基層實(shí)驗(yàn)室和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)化驗(yàn)室推廣應(yīng)用.

［1］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 5009.34—2003食品中亞硫酸鹽的測(cè)定［S］.北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003：269-273.

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Determ ination of Sulfite in Foods Based on Lum inol Chem ilum inescence

WANG Jian-qing， XU Li-hong*， ZHANG Yu， WANGWei， HU Qi
（Institute of Quality and Standard for Agro-Products，Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 310021，China）

The chemiluminescence technology was selected to establish a new method for the determination of sulfites in foods.Various factors affecting the chemiluminescence detection were evaluated and the optimum determination conditions were obtained in this study.The detection limit of themethod was4.6 mg/kg.In the range of 1.0-10.0 mg/L，the sulfite concentration was positively correlated with the luminous intensity value（ΔI），and the correlation coefficient（R2）was0.993 4.Spike recovery tests of six different samples were evaluated.The average RSD was 3.05% and the average recovery was 93.0%.Chemiluminescence determination results indicated that the new method was a good candidate for the qualitative and quantitative analysis of sulfites in foods.

luminol reagent；sulfite；chemiluminescence

檀彩蓮）

TS207.5；O657.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2014.01.012

2095-6002（2014）01-0065-04

王建清，徐麗紅，張玉，等.魯米諾化學(xué)發(fā)光法測(cè)定食品中的亞硫酸鹽.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2013，32（1）：65-68. WANG Jian-qing，XU Li-hong，ZHANG Yu，et al.Determination of sulfite in foods based on luminol chemiluminescence. Journal of Food Science and Technology，2014，32（1）：65-68.

2013-07-16

浙江省科技廳重大科技專項(xiàng)（2009C12052）；浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前瞻性項(xiàng)目（2009C32093）.

王建清，男，實(shí)驗(yàn)師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)測(cè)試研究工作；*徐麗紅，女，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全及檢測(cè)方面的研究.通訊作者.