韓亞鵬，范小峰，史紅全，許姝娟，陳德來，張小霞

(1. 甘肅省高校隴東生物資源保護與利用省級重點實驗室;2. 慶陽市中心血站，甘肅 慶陽 745000)

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人類對能源的需求不斷擴大，石油的開發(fā)利用也迅速發(fā)展。而同時石油的開采、冶煉、使用和運輸過程的污染和遺漏事故，以及含油廢水的排放、污水灌溉、各種石油制品的揮發(fā)、完全燃燒物飄落等也都引起一系列石油污染問題。隨著人們對環(huán)境問題的日益關(guān)注，石油污染研究也不斷加強。

渦蟲(D. japonica)隸屬于扁形動物門、渦蟲綱、渦蟲屬動物，是首先出現(xiàn)兩側(cè)對稱、三胚層的動物，在動物系統(tǒng)演化中具有特殊地位。渦蟲有很強的再生能力，是研究再生的理想材料，且具有分布廣、個體小、結(jié)構(gòu)簡單、易培養(yǎng)、對水質(zhì)變化敏感性強等特點，被常作為一類很好的水體污染指示生物。［1］近年來，用日本三角渦蟲進行水生態(tài)毒理學(xué)的研究較多，主要涉及重金屬離子對渦蟲的急性毒性作用，［2］洗滌劑磷對日本三角渦蟲生長的影響，［3］農(nóng)藥對日本三角渦蟲攝食與再生的影響，［4－5］環(huán)境中無機鹽對三角渦蟲再生的影響［6］，而關(guān)于石油污染物對渦蟲攝食與再生的影響未見相關(guān)報道。通過研究石油污染物對日本三角渦蟲的急性毒性及攝食與再生的影響，探討水環(huán)境中石油污染物對水生動物生長的影響，為利用日本三角渦蟲檢測環(huán)境污染提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物和試劑

試驗所用日本三角渦蟲采自甘肅省慶陽市合水縣馬蓮河邊山泉。日本三角渦蟲在實驗室喂養(yǎng)期間，每隔4d 用豬肝喂食一次，其間每喂食后4h 換隔夜自來水。試驗前3d 停止喂食，試驗溫度為(21 ±1)℃。

石油購自慶陽市西峰油田第二煉油廠;試驗用水為實驗室隔夜自來水。

1.2 急性毒性試驗

1.2.1 預(yù)試驗

首先配置不同濃度試驗液，對日本三角渦蟲處理48h，經(jīng)多次重復(fù)試驗，得出處理24h、48h 石油污染物中日本三角渦蟲100%致死的最低濃度b和0 致死的最高濃度a，分別記為b1、b2、a1、a2。

1.2.2 急性毒性試驗

采用靜水試驗法，周期為24h 和48h。急性毒性試驗按照國家環(huán)境保護局(2002)水和廢水監(jiān)測分析方法進行。根據(jù)預(yù)試驗中所得的全致死和全不致死的濃度范圍，按等對數(shù)間距分別設(shè)置毒性試驗濃度梯度。24h 試驗，濃度梯度分別為71.70、76.73、82.10、87.83、94.00、100.57g/L;48h試驗，濃度梯度分別為50.00、52.43、55.13、57.87、60.76、63.33g/L。并分別設(shè)以對照。每組10 條日本三角渦蟲，各設(shè)三個平行。

試驗開始時，將配置好的不同濃度的石油污染物加入300mL 隔夜自來水，攪拌后靜置，后將挑選的日本三角渦蟲(最大伸展體長8 ～10mm)移入各個燒杯中，每個燒杯10 條。每隔6h 觀察并記錄日本三角渦蟲的形態(tài)變化和存活數(shù)，以日本三角渦蟲不蠕動記為死亡，［3］根據(jù)BL－420S 生物機能實驗系統(tǒng)計算24h、48h 的LC50值。

1.3 日本三角渦蟲攝食的實驗

攝食試驗濃度的設(shè)定主要參考石油污染物的安全濃 度 值［SC = LC50，24h× 0.3 ÷ (LC50，24h÷LC50，48h)3］，［7］石油污染物濃度分別設(shè)置為3.33、6.67、10.00、13.33、16.67g/L。每組10 條日本三角渦蟲，每個濃度設(shè)三個重復(fù)，并各設(shè)以對照。

日本三角渦蟲攝食實驗開始時，先配置各個濃度的石油污染物溶液，待溶液澄清后，選擇大小及生長狀態(tài)相近的日本三角渦蟲放入各個燒杯;待日本三角渦蟲運動靜止后(約30min)，在燒杯正中投喂一小塊熟雞蛋黃，并在喂食后的10、30、60min 觀察渦蟲攝食情況，為防水質(zhì)變化和水分蒸發(fā)，每次喂食4h 后將渦蟲移到新的測試液并于燒杯加蓋后培養(yǎng)觀察。以后每隔24h 喂食一次，并分別于喂食后的10、30、60min 觀察日本三角渦蟲攝食情況，記錄日本三角渦蟲攝食個數(shù)，試驗持續(xù)3d。每次喂食后將日本三角渦蟲腸管呈黃色定義為渦蟲已攝食。［8］

1.4 日本三角渦蟲再生的試驗

參考石油污染物的安全濃度值［SC］，設(shè)置5個濃度組和1 個對照組，石油污染物的濃度分別為3.33、6.67、10.00、13.33、16.67g/L。每個濃度設(shè)3 個重復(fù)，每個重復(fù)10 條日本三角渦蟲。

再生試驗開始時，將日本三角渦蟲逐條移至培養(yǎng)皿中用消毒刀片緊貼耳突后切去頭部，收集“無頭”日本三角渦蟲放入盛有各濃度石油污染物的燒杯中進行再生觀察。術(shù)后72h 開始，每隔6h于體視顯微鏡下進行1 次日本三角渦蟲眼點再生觀察并記錄，以眼點重新出現(xiàn)作為再生完成的標(biāo)志。［9］實驗至128h (6d)，為提高觀察效果，將完成眼點再生的渦蟲移出，另行飼養(yǎng)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用BL－420S 生物機能實驗系統(tǒng)對石油污染物對日本三角渦蟲的急性毒性數(shù)據(jù)進行分析;采用spss11.5 統(tǒng)計軟件分別對日本三角渦蟲攝食與再生的試驗數(shù)據(jù)進行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同石油污染物對日本三角渦蟲的急性毒性

2.1.1 石油污染物對日本三角渦蟲的半數(shù)致死濃度

急性毒性試驗結(jié)果(表1)表明，石油污染物對日本三角渦蟲的24h、48h LC50分別為83.47、56.83g/L，石油污染物對日本三角渦蟲的安全濃度為7.90g/L。

表1 石油污染物對日本三角渦蟲的急性毒性Tab 1 Acute toxicity of oil pollutant to D.japonica(n=10)

2.1.2 日本三角渦蟲在不同石油污染物中的中毒狀態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)日本三角渦蟲在不同濃度的石油污染物中，其中毒形態(tài)存在一定差異。在石油污染物處理早期，主要表現(xiàn)為翻轉(zhuǎn)、扭曲、螺旋、卷曲4 種狀態(tài)。低濃度污染物作用下，48h 可明顯觀察到在日本三角渦蟲軀體周圍有透明凝膠狀物質(zhì)及內(nèi)含的白色顆粒物，偶爾觀察到日本三角渦蟲體表有呈放射狀分布的白色針狀結(jié)晶物存在;在高濃度或長期作用時，日本三角渦蟲死亡，其軀體膨脹呈白色，有時可看到咽露出或脫落。

2.2 石油污染物對日本三角渦蟲攝食的影響

表2 顯示，各濃度石油污染物對日本三角渦蟲攝食均有一定影響。攝食時間相同，攝食個數(shù)隨污染濃度增大而減少;相同濃度下，攝食個數(shù)隨染毒時間延長而減少，24h 后差異顯著 (p ＜0.05)。染毒24 ～48h 后，日本三角渦蟲的攝食強度與污染濃度呈負相關(guān)，不同濃度石油污染物對日本三角渦蟲的攝食影響差異顯著，石油污染物對渦蟲的攝食影響隨石油污染物濃度的增大與染毒時間的延長而增大。

表2 石油污染物對日本三角渦蟲攝食的影響Tab 2 Effect of oil pollutant on ingestion of D.japonica (n=10，mean±SE)

2.3 石油污染物對日本三角渦蟲再生的影響

表3 石油污染物對日本三角渦蟲再生的影響Tab 3 Effect of oil pollutant on D.japonica regeneration (n=10，mean±SE)

表3 顯示，不同濃度石油污染物對日本三角渦蟲再生的影響不同。低濃度(≤6.67g/L)的石油污染對日本三角渦蟲再生的影響不顯著(p ＞0.05);當(dāng)污染濃度升高至10.00g/L 時，對日本三角渦蟲再生的影響達顯著水平(p ＜0.05)，且再生速度與濃度呈負相關(guān)。但隨著處理時間的延長，石油污染物的影響逐漸減小;術(shù)后112h，石油污染物濃度≤10.00g/L 組中的日本三角渦蟲完成再生，而至試驗結(jié) 束，13.33 和16.67g/L 處 理 組 有16.67% 與56.70%的日本三角渦蟲死亡，沒有完成再生。

3 討論

3.1 石油污染物對日本三角渦蟲的急性毒性作用

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)石油污染物對日本三角渦蟲24hLC50為83.47g/L，48hLC50為56.83g/L，其急性毒性屬于低毒(LC50＞10mg/L)，它對日本三角渦蟲生存的影響與廢舊電池浸泡液［5］和農(nóng)藥［4］，［8］毒性一致，即隨污染濃度增大和作用時間的延長，日本三角渦蟲的死亡率增大。

日本三角渦蟲在高濃度的石油污染物中有扭曲，翻轉(zhuǎn)，卷曲，甚至咽部脫落，死亡等現(xiàn)象，這些現(xiàn)象與用N－N 二甲基甲酰胺［9］，重金屬離子［2］處理渦蟲后的形態(tài)表現(xiàn)相似。渦蟲這些形態(tài)表現(xiàn)和死亡現(xiàn)象與石油污染物的理化性質(zhì)相關(guān)，石油組成成分主要包括飽和烴、芳香烴類、瀝青質(zhì)和樹脂等，作為污染物以石油薄膜、焦油團塊、乳狀和溶液狀等三種形式存在于水中［10］。油膜覆蓋在水溶液表面，嚴重影響了水與大氣中氧氣和二氧化碳的吸收［11］，水中氧化速度，氧氣更換速度大大降低［12］，嚴重影響了水中的氧含量，促使渦蟲缺氧死亡;焦油團塊中重油、焦油和芳香族碳氫化合物成分越多，其毒性越大［11］，且濃度高時，直接粘附于渦蟲體表，使其不能活動而死亡，另一方面石油烴會破壞蟲體細胞膜的正常結(jié)構(gòu)和透性，干擾渦蟲體內(nèi)的酶系［13］，進而影響了渦蟲體內(nèi)的生理生化過程，導(dǎo)致渦蟲死亡;此外，在石油污染物的毒理作用下日本三角渦蟲咽部與腸部結(jié)合部位的細胞表面粘著因子和胞外基質(zhì)的某些糖蛋白的結(jié)構(gòu)可能發(fā)生了較大變化，從而導(dǎo)致胞外基質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的改變，細胞間粘連程度降低［6］，致使日本三角渦蟲咽部脫落。

3.2 石油污染物對日本三角渦蟲攝食的影響

石油污染物對日本三角渦蟲的攝食影響隨石油污染物濃度的增大與染毒時間的延長而增大。說明石油污染物對日本三角渦蟲的攝食影響既有劑量效應(yīng)也有時間效應(yīng)。石油污染物對日本三角渦蟲攝食的影響，可能是石油污染物直接粘附在渦蟲體表，阻滯和破壞了與攝食相關(guān)的化學(xué)感受器的作用［8］，或者是石油污染物中毒性碳氫化合物作用于蟲體使三角渦蟲減少攝食或不再攝食。

染毒第1d 日本三角渦蟲攝食略有異常，即距喂食60min 時，各濃度石油污染物未減少對日本三角渦蟲的攝食蟲數(shù)，這與石油污染物的時間效應(yīng)有關(guān)，即石油污染物對日本三角渦蟲處理時間越短，毒害效應(yīng)越不明顯。同時也說明60min 是石油污染物對日本三角渦蟲的攝食影響的時間效應(yīng)臨界值。

3.3 石油污染物對日本三角渦蟲再生的影響

在觀察日本三角渦蟲再生時，通過體視顯微鏡以觀測到日本三角渦蟲再生出眼點為再生完成標(biāo)志，考慮到不同濃度組日本三角渦蟲再生時間、速度都不相同，觀察次數(shù)越多，觀察時間越早，數(shù)據(jù)越精確，因此，試驗中從術(shù)后72h 開始觀察，并每隔8h 觀察一次。

試驗中(＞10g/L)的石油污染物即可延緩日本三角渦蟲再生，且石油污染物濃度越高，對再生的抑制作用越明顯。推測其原因是在較低濃度范圍內(nèi)日本三角渦蟲可以通過自身調(diào)節(jié)減緩或削弱石油污染物的毒害作用，雖然時間延遲，但仍然可以完成再生;在相對較高濃度的持續(xù)作用下，日本三角渦蟲機體調(diào)節(jié)系統(tǒng)被破壞，無法完成再生，最終死亡。

試驗中隨著處理時間的延長，石油污染物對日本三角渦蟲再生的影響減小，這可能是因為再生早期日本三角渦蟲對石油污染物的刺激產(chǎn)生了應(yīng)激機制，再生差異顯著，隨著時間延長，日本三角渦蟲對石油污染物的刺激出現(xiàn)適應(yīng)，再生速度的差異減小或消失。

3.4 石油污染物對日本三角渦蟲攝食與再生影響的濃度差異

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，濃度≥3.33g/L 的石油污染物對日本三角渦蟲的攝食有影響，但對再生有影響的濃度是≥10.00g/L，可見石油污染物對日本三角渦蟲攝食的影響濃度小于對再生的影響濃度，且低于安全濃度值，說明渦蟲對水質(zhì)污染響應(yīng)明顯。按常規(guī)分析，切割對日本三角渦蟲的傷害很大，石油污染物對其再生的影響濃度應(yīng)該小于對攝食的影響濃度，而出現(xiàn)這種情況原因有兩種，一是渦蟲再生過程運動減少，未出現(xiàn)攝食行為，阻斷了石油污染物從口咽進入體內(nèi)的途徑;此外可能原因是再生過程中日本三角渦蟲成體多能干細胞(neoblasts)在切口處大量擴散增殖形成胚基［14，15］，由于胚基的形成而阻滯了石油污染物通過切口對日本三角渦蟲的毒害作用。

從日本三角渦蟲的急性毒性、攝食、再生三方面研究表明，石油污染物對日本三角渦蟲有較明顯的生物毒性，特別是日本三角渦蟲對石油污染的攝食反應(yīng)最為敏感，說明利用日本三角渦蟲檢測水環(huán)境中的石油污染有較好的應(yīng)用前景。

［1］Liu D－Z.Chinese Freshwater Turbellarians Beijing［M］.Beijing Normal University Press，1993:181－182

［2］趙江沙，曾兆. 銅、汞、鉛對渦蟲的急性毒性作用［J］. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2004，10(6):750－753

［3］劉昌平，劉昌利，王希，等. 洗滌劑磷對日本三角渦蟲生長的影響［J］. 環(huán)境科學(xué)導(dǎo)刊，2007，26(3):61－63

［4］劉昌利，席貽龍，黃林，等. 敵百蟲和敵殺死對日本三角渦蟲攝食與再生的影響［J］. 環(huán)境與健康雜志，2010，27(7):601－604

［5］劉昌利，席貽龍，黃林，等. 草甘膦、乙草胺對日本三角渦蟲攝食與再生的影響［J］. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2008，19(11):2509－2514

［6］薛得明，陳廣文，李靜靜，等. 環(huán)境中無機鹽對三角渦蟲再生的影響［J］. 生物學(xué)雜志，2008，25(4):20－22

［7］Zhou Y－X(周永欣)，Zhang Z－S(章宗涉).Methods of Toxicity Test for Aquatic Animals Beijing［M］.China Agriculutural press，1989:1335－1339

［8］劉昌利，韋傳寶，吳永明，等.5 種廢舊電池浸泡液對日本三角渦蟲生存與攝食的影響［J］. 癌變 畸變 突變，2007，19(32):238－238

［9］姚艷需，李治，孫艷，等.N－N 二甲基乙胺對東亞三角渦蟲的毒性效應(yīng)［J］. 西北大學(xué)學(xué)報，2011，41(5):833－837

［10］沈南南，李純厚，王曉偉，等. 石油污染對海洋浮游生物的影響［J］. 生物技術(shù)通報(增刊)，2006:95－100

［11］曲維政，鄧聲貴，岳淑紅. 海洋石油污染對海氣正常交換過程的破壞性影響［J］. 自然災(zāi)害學(xué)報，2002，11(4):55－59

［12］曲維政，鄧聲貴. 災(zāi)害性的海洋石油污染［J］. 自然災(zāi)害學(xué)報，2001，10(1):69－74

［13］Мониин.А，Войтов.В，李若鈍. 世界海洋石油污染物的地理分布及其消亡規(guī)律的研究［J］. 海岸工程，1995，14(1):27－30

［14］Newmark PA，Sanchez Alvarado A.Not your father＇s planarian:A classic model enters the era of functional genomics［J］.Nat Rev Genet，2002，3(2):210－219

［15］Reddien PW，Oviedo NJ，Jennings JR，et al.SMEDWI is a PIWI－like protein that regulates planarian stem cells［J］.Science，2005，310(5752):1327－1330