張圓林, 王昌祿, 陳勉華, 李風(fēng)娟, 李貞景, 王玉榮

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院/食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

高產(chǎn)γ-氨基丁酸的紅曲霉菌株篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

張圓林, 王昌祿*, 陳勉華, 李風(fēng)娟, 李貞景, 王玉榮

(天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院/食品營(yíng)養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

從實(shí)驗(yàn)室保藏的11種紅曲霉中,篩選出高產(chǎn)γ-氨基丁酸的紅曲霉CH-1菌株.研究了發(fā)酵溫度、時(shí)間、接種量、谷氨酸鈉添加量等發(fā)酵條件對(duì)紅曲霉CH-1產(chǎn)GABA含量的影響.經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)后得出紅曲霉CH-1發(fā)酵大米產(chǎn)γ-氨基丁酸的較佳發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度30℃,發(fā)酵時(shí)間9 d,接種量17%,谷氨酸鈉添加量0.10 g,在此條件下,紅曲霉CH-1發(fā)酵大米產(chǎn)GABA 為1.93mg/g,經(jīng)高效液相色譜檢測(cè),桔霉素含量為0.01μg/g,低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)1μg/g,可利用該產(chǎn)品開(kāi)發(fā)更多形式的紅曲食品.

紅曲霉;γ-氨基丁酸;發(fā)酵

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種非蛋白質(zhì)氨基酸,廣泛存在于原核生物和真核生物中,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[1-2],具有調(diào)節(jié)心血管活動(dòng)、改善腦功能、改善肝腎功能、鎮(zhèn)靜、提高記憶力等多種生理功能[3-10]. GABA作為一種新型的功能性因子,廣泛用于食品、醫(yī)藥和飼料工業(yè)中[11-14].

目前,GABA的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和生物法.化學(xué)合成法由于價(jià)格昂貴、安全性較低,不適于在食品、藥品等工業(yè)中應(yīng)用.生物法包括植物富集法和微生物發(fā)酵法,其中微生物發(fā)酵法因其成本低、含量高、安全性好等優(yōu)點(diǎn),受到了廣泛關(guān)注[2].紅曲霉發(fā)酵可產(chǎn)生GABA,還能產(chǎn)生其他功能活性物質(zhì),如莫納可林K(Monacolin K)、色素、麥角甾醇等,大多數(shù)紅曲霉在代謝過(guò)程中還可能產(chǎn)生桔霉素,它是一種具有腎毒性的真菌毒素,對(duì)人體有害,其含量直接影響紅曲產(chǎn)品的安全性[15-16],因此在紅曲霉發(fā)酵過(guò)程中也應(yīng)該注意桔霉素含量.

本研究從實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的11種紅曲霉菌株中,篩選出一株高產(chǎn)GABA的紅曲霉CH-1,研究了溫度、時(shí)間、接種量、谷氨酸鈉添加量等發(fā)酵條件對(duì)紅曲霉產(chǎn)GABA含量的影響.通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn),優(yōu)化了高產(chǎn)GABA的最佳發(fā)酵條件,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)紅曲霉產(chǎn)品提供參考.

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

1.1.1 菌種

實(shí)驗(yàn)室保藏紅曲霉菌株:M1,M2,M3,M4,M7, CH-1,CH-2,CH-3,CS-1,CS-2,CS-4.

1.1.2 試劑

乙腈、甲醇(色譜純),德國(guó)CNW公司;GABA標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%),桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%),均為美國(guó)Sigma公司生產(chǎn).

1.2 培養(yǎng)基及溶液配制

斜面培養(yǎng)基(g/L):麥芽浸粉140 g,瓊脂粉20 g,121℃滅菌20min.

種子液培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖60 g,蛋白胨20 g,NaNO310 g,MgSO4·7H2O 5 g,KH2PO410 g,自來(lái)水1 000 mL,121℃滅菌20 min(試劑均為分析純).

固體發(fā)酵培養(yǎng)基:大米,購(gòu)于天津農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);將大米經(jīng)自來(lái)水浸泡過(guò)夜,分裝入250 mL三角瓶中,每瓶28 g原料,自來(lái)水12m L,121℃滅菌20 min.

衍生劑:鄰苯二甲醛(OPA)80 mg,β-巰基乙醇80μL,甲醇10mL(OPA及β-巰基乙醇為生化試劑,甲醇為色譜純).

硼酸緩沖液:硼酸2.47 g,水100 m L,用NaOH 調(diào)pH值至10.4(試劑均為分析純).

1.3 主要儀器

8453型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),美國(guó)安捷倫科技有限公司;1200s型高效液相色譜儀(配有紫外檢測(cè)器、熒光檢測(cè)器和 B.04.03.SPI87色譜工作站)美國(guó)安捷倫科技有限公司;LRH-250-GⅡ型微電腦控制光照培養(yǎng)箱,廣東省醫(yī)療器械廠.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 紅曲霉菌種活化

用接種環(huán)從不同紅曲霉菌株的試管斜面上各挑取一環(huán)孢子,接入100 mL種子液培養(yǎng)基中,30℃180 r/min培養(yǎng)36 h后備用.

1.4.2 菌種篩選

在無(wú)菌條件下,分別將活化后的菌種培養(yǎng)液進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾,計(jì)數(shù),將其濃度調(diào)整至2×106個(gè)/m L.各吸取5 mL,接入固體發(fā)酵培養(yǎng)基中,25℃培養(yǎng)5 d,分別進(jìn)行取樣,測(cè)定其中GABA含量,篩選出產(chǎn)GABA含量較高的紅曲霉菌株.

1.4.3 GABA測(cè)定方法

1.4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將濃度為500μg/mL的GABA標(biāo)準(zhǔn)水溶液,稀釋成10,20,50,100,200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列.以不同GABA標(biāo)準(zhǔn)水溶液濃度為橫坐標(biāo),以HPLC法測(cè)定的峰面積數(shù)值為縱坐標(biāo),繪圖得到GABA標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.4.3.2 樣品處理

取不同紅曲霉發(fā)酵樣品,60℃烘干至恒重,粉碎,過(guò)100目篩.準(zhǔn)確稱取0.500 0 g樣品,加入4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的TCA溶液,30℃水浴2 h,轉(zhuǎn)至離心管中,10 000 r/min離心10min,用TCA定容至5mL.吸取1mL經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾,經(jīng)在線衍生(2μL樣品溶液和2μL衍生劑)8 min,立即進(jìn)行HPLC檢測(cè).

1.4.3.3 色譜條件

色譜柱:Agilent Eclipse AAA(150 mm×4.6 mm,5μm);采用梯度洗脫,流動(dòng)相A為純凈水,1 L, 加1.6‰醋酸鈉(分析純)調(diào)pH值為7.2;流動(dòng)相B為甲醇∶乙腈∶純凈水=45∶45∶10(體積比),1 L,加1.6‰的醋酸鈉,調(diào)pH值為7.2;0～2min流動(dòng)相B 為20%,2～18min流動(dòng)相B由20%上升至100%,維持4 min,在22～26 min內(nèi),流動(dòng)相B由100%降至20%.檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)為338 nm,柱溫為25℃,流速為1mL/min,進(jìn)樣量為2μL.

1.4.4 桔霉素測(cè)定方法

1.4.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將質(zhì)量濃度為500μg/m L的桔霉素乙腈標(biāo)準(zhǔn)溶液分別配制成質(zhì)量濃度為0,0.05,0.10,0.50, 1.00,2.00,5.00,10.00 g/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液.以不同濃度的桔霉素標(biāo)準(zhǔn)水溶液濃度為橫坐標(biāo),以HPLC法測(cè)定的峰面積數(shù)值為縱坐標(biāo),繪圖得到桔霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.4.4.2 樣品處理

取不同紅曲霉發(fā)酵樣品,60℃烘干至恒重,粉碎,過(guò)100目篩.準(zhǔn)確稱取0.500 0 g樣品,置于20 m L離心管中,加入8 mL體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇,超聲波處理30 min,3 000 r/min離心10 min,重復(fù)3 次,合并上清液,定容至25mL,靜置30min,經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后用HPLC法檢測(cè)桔霉素含量.

1.4.4.3 色譜條件

色譜柱,Agilent TC-C18(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相為V(乙腈)∶V(甲醇)∶V(水)=70∶10∶20(用磷酸調(diào)pH值為2.66～2.68);熒光檢測(cè)器,檢測(cè)波長(zhǎng)λex=331 nm,λem=500 nm;柱溫25℃;流速1 mL/min;進(jìn)樣量20μL.

2 結(jié)果與討論

2.1 高產(chǎn)GABA的紅曲霉菌株的篩選

不同的紅曲霉菌株,GABA的產(chǎn)量不同,結(jié)果如圖1.

由圖1可以看出不同的紅曲霉菌株GABA產(chǎn)量多少排序?yàn)?CH-1＞CH-2＞CH-3＞M4＞CS-1＞M3＞CS-4＞M1＞CS-2＞M7＞M2,其中紅曲霉CH-1產(chǎn)量為0.6mg/g,因此,選擇紅曲霉CH-1菌株繼續(xù)深入研究.

圖1 不同紅曲霉菌株GABA產(chǎn)量Fig.1 GABA yield of different monascus

2.2 發(fā)酵條件對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響

2.2.1 發(fā)酵溫度對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響

溫度是影響紅曲霉生長(zhǎng)的一個(gè)重要因素,向固體發(fā)酵培養(yǎng)基中接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%已調(diào)濃度的紅曲霉CH-1菌液,分別將其放入21,24,27,30,33℃培養(yǎng)箱中,7 d后取樣檢測(cè),結(jié)果如圖2.

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)GABA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of fermentation temperature on GABA yield

由圖2可知,溫度在21～30℃時(shí),紅曲霉CH-1發(fā)酵大米產(chǎn)GABA的含量隨著溫度的升高而增加, 在30℃時(shí)達(dá)到最大,為1.25mg/g,即比21℃培養(yǎng)時(shí)提高了2倍.但發(fā)酵溫度繼續(xù)提高,GABA的產(chǎn)量下降,可能是由于溫度過(guò)高時(shí)發(fā)酵過(guò)程中的谷氨酸脫羧酶的活性降低,而降低了GABA的產(chǎn)量.

2.2.2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響

向固體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%已調(diào)濃度的紅曲霉菌懸液,將其放入溫度為30℃的恒溫培養(yǎng)箱中,分別于3,6,9,12,15 d取樣檢測(cè),研究發(fā)酵時(shí)間對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響,結(jié)果如圖3.

由圖3可知,在紅曲霉發(fā)酵過(guò)程中,從發(fā)酵第3天到第9天過(guò)程中,紅曲霉CH-1發(fā)酵大米產(chǎn)GABA的含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,在第9天時(shí)達(dá)到最高,為1.65mg/g;隨著時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng),其產(chǎn)量則隨之降低.因此,控制適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵時(shí)間,可獲得較高的GABA產(chǎn)量.

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)GABA產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of fermentation time on GABA yield

2.2.3 紅曲霉接種量對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響

向固體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%,11%,14%,17%,20%已調(diào)濃度的紅曲霉菌懸液,30℃培養(yǎng),9 d后取樣檢測(cè),結(jié)果如圖4.

圖4 紅曲霉接種量對(duì)GABA產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of monascus inoculum on GABA yield

由圖4可知,紅曲霉接種量對(duì)紅曲霉CH-1產(chǎn)GABA影響較大.隨著紅曲霉接種量的增加,紅曲霉CH-1發(fā)酵大米產(chǎn)GABA的含量也隨之增加,當(dāng)接種量為17%時(shí),GABA產(chǎn)量最高,為1.83 mg/g.隨著接種量的繼續(xù)增大,GABA的含量略有下降,這可能因?yàn)榧t曲霉接種量較小時(shí),菌種的適應(yīng)期和對(duì)數(shù)期會(huì)相對(duì)延長(zhǎng),處于生長(zhǎng)繁殖階段的菌體的發(fā)酵能力較差,導(dǎo)致GABA的產(chǎn)量較低;而紅曲霉接種量過(guò)多時(shí),會(huì)造成其發(fā)酵時(shí)間縮短,降低了GABA的含量.考慮到GABA的產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)成本,最適的紅曲霉接種量確定為17%.

2.2.4 谷氨酸鈉添加量對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響

紅曲霉發(fā)酵過(guò)程中能產(chǎn)生谷氨酸脫羧酶,可以促使谷氨酸鈉轉(zhuǎn)化為GABA.因此,向固體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入谷氨酸鈉的質(zhì)量為0,0.05,0.10, 0.15,0.20 g,接入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為17%已調(diào)濃度的紅曲霉菌懸液,將其放置于溫度為30℃的恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)9 d后取樣檢測(cè),研究谷氨酸鈉添加量對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)量的影響,結(jié)果如圖5.

圖5 谷氨酸鈉添加量對(duì)GABA產(chǎn)量的影響Fig.5 Effects of sodium glutamate content on GABA yield

由圖5可知,隨著谷氨酸鈉添加量的增加,紅曲霉CH-1發(fā)酵大米產(chǎn)GABA的含量也隨之增加.在谷氨酸鈉添加量為0.10 g時(shí),GABA的含量達(dá)到最高,為1.92 mg/g.隨著谷氨酸鈉添加量的繼續(xù)增大,生成GABA量受到抑制,甚至產(chǎn)量下降.

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,以發(fā)酵溫度、時(shí)間、紅曲霉接種量、谷氨酸鈉添加量進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),確定紅曲霉發(fā)酵大米產(chǎn)GABA量的最佳發(fā)酵參數(shù).正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1.

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Tab.1 Factors and levels of orthogonal design

正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2.

利用正交助手進(jìn)行分析.由極差R得出,4個(gè)因素對(duì)紅曲霉發(fā)酵大米產(chǎn)GABA的含量影響程度由高到低順序?yàn)?發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、紅曲霉接種量、谷氨酸添加量,由正交試驗(yàn)k值分析可以得知,最優(yōu)水平為A2B2C2D2.

正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果見(jiàn)表3.從表3可以看出,發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間均為顯著因素,其中發(fā)酵溫度的顯著性大于發(fā)酵時(shí)間的顯著性.綜合k值和正交實(shí)驗(yàn)方差分析結(jié)果可得,紅曲霉CH-1發(fā)酵大米產(chǎn)GABA含量的最佳發(fā)酵參數(shù)為:發(fā)酵溫度為30 ℃,發(fā)酵時(shí)間為9 d,紅曲霉接種量為17%,谷氨酸添加量為0.10 g.

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Orthogonal design and experimental results

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.3 Anova of orthogonal test

2.4 優(yōu)化后紅曲米樣品中GABA和桔霉素的含量檢測(cè)

桔霉素作為一種真菌毒素,對(duì)人體有害,若其含量超過(guò)0.2μg/g,產(chǎn)品將不能達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),因此,應(yīng)檢測(cè)桔霉素的含量,以保證產(chǎn)品的安全性.采用正交試驗(yàn)所得最佳條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),對(duì)所得樣品中GABA和桔霉素的高效液相色譜分析結(jié)果見(jiàn)圖6.由圖6(a)可知,紅曲霉樣品中GABA的保留時(shí)間為16.246min,含量為1.93mg;由圖6(b)可知,桔霉素的保留時(shí)間為4.856min,含量為0.01μg/g,符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的桔霉素含量必須低于1μg/g的要求.

3 結(jié) 論

圖6 紅曲霉樣品中GABA和桔霉素高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of GABA and citrinin in samples

根據(jù)實(shí)驗(yàn)得知溫度和時(shí)間對(duì)紅曲發(fā)酵產(chǎn)GABA的含量有顯著影響,其較佳發(fā)酵條件為:紅曲霉接種量17% 、溫度30℃、時(shí)間9 d、谷氨酸鈉添加量0.10 g.在此條件下,紅曲霉CH-1產(chǎn)GABA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.93mg/g,比優(yōu)化前提高了3.22倍,即可望利用紅曲霉CH-1進(jìn)行富含GABA功能因子的多種產(chǎn)品研發(fā),也可通過(guò)實(shí)驗(yàn)選擇合適的粗糧如玉米、小米、燕麥等作為發(fā)酵基質(zhì),進(jìn)一步提高發(fā)酵物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值;目前國(guó)內(nèi)外常見(jiàn)的GABA類食品多以飲料為主,因此,在豐富GABA類食品種類方面,還需要做大量的研究.

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Screening of High GABA-production by Monascus and Optim ization of its Fermentation Conditions

ZHANG Yuanlin, WANG Changlu*, CHEN Mianhua, LIFengjuan, LIZhenjing, WANG Yurong
(College ofFood Engineering and Biotechnology/Key Laboratory ofFood Nutrition and Safety ofMinistry of Education,Tianjin University ofScience and Technology,Tianjin 300457,China)

To screen high GABA-producing Monascus strains from the laboratory,effects of Monascus inoculum,temperature,time,and the sodium glutamate content on GABA production were studied.Taking the production of GABA as the index,single factors and the orthogonal experimentwere implemented to attain the optimum fermentation conditions,the temperature of Monascus CH-1 30℃,optimum fermentation time nine days,optimum inoculation 17%,and optimum dosage of sodium glutamate 0.10 g. The GABA yield by Monascus CH-1 was1.93mg/g and the citrinin contentwas0.01μg/g below the national standards.Themore forms of red kojic rice food product can be developed.

monascus;γ-aminobutyric acid;fermentation

葉紅波)

TS201.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2014.05.007

2095-6002(2014)05-0035-06

張圓林,王昌祿,陳勉華,等.高產(chǎn)γ-氨基丁酸的紅曲霉菌株篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào),2014,32 (5):35-40. ZHANG Yuanlin,WANG Changlu,CHEN Mianhua,et al.Screening of high GABA-production by Monascus and optimization of its fermentation conditions.Journal of Food Science and Technology,2014,32(5):35-40.

2013-12-28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31171729).

張圓林,女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù);*王昌祿,男,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事食品生物技術(shù)方面的研究.通訊作者.