任大勇, 翁璐超, 劉宏鋒, 周亭亭, 張振業(yè), 邵麗芳

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,吉林長春 130118;2.吉林大學動物醫(yī)學學院,吉林長春 130062)

乳酸菌體外降解膽固醇的影響因素研究

任大勇1, 翁璐超1, 劉宏鋒2, 周亭亭1, 張振業(yè)1, 邵麗芳1

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,吉林長春 130118;
2.吉林大學動物醫(yī)學學院,吉林長春 130062)

研究了影響乳酸菌體外降解膽固醇的4個因素:膽鹽質量濃度、膽固醇質量濃度、培養(yǎng)基初始pH值和菌體培養(yǎng)時間.結果表明,受試菌株的降解能力顯著受上述因素的影響;在相同條件下,不同菌株的降解能力差異顯著.總體上,膽鹽質量濃度為4～6mg/mL,膽固醇質量濃度為190～230mg/L,培養(yǎng)基初始pH值在5～7,菌體培養(yǎng)時間11～23 h時,乳酸菌降解膽固醇的能力最高,達到50%以上.

乳酸菌;膽固醇;影響因素;體外

膽固醇與心腦血管疾病、高血脂等疾病的發(fā)作有密切的關系.臨床研究表明,總膽固醇水平每升高1mmol/L,冠心病死亡的概率就會增加35%[1].近年來國內外的大量研究表明,乳酸菌對膽固醇具有較強的降解作用,適量長期飲用乳酸菌發(fā)酵的乳制品具有降低血清膽固醇含量的作用.目前,研究人員開展了一系列乳酸菌降低膽固醇的實驗,目的在于篩選優(yōu)良菌株,開發(fā)功能性乳酸菌制品[2-3].研究表明,很多因素都可以影響乳酸菌對膽固醇的降解能力,例如膽固醇濃度、膽鹽濃度、培養(yǎng)基的初始的pH值、乳酸菌培養(yǎng)時間等[4].本文對不同乳酸菌菌株在不同的培養(yǎng)條件下體外降解膽固醇能力的影響做了研究,旨在明確乳酸菌發(fā)揮降膽固醇作用的最佳條件,為科學使用益生菌提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳酸菌菌種

實驗選取6種乳酸菌:發(fā)酵乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、糞腸球菌、德氏乳桿菌乳酸亞種、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌,均為吉林農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院保存.

1.1.2 實驗試劑

MRS培養(yǎng)基,青島海博生物公司;牛膽鹽,中國惠世有限公司;膽固醇,北京鼎國有限公司;硫代乙醇酸鈉、正己烷、二甲亞砜、95%乙醇、氫氧化鉀、硫酸、鄰苯二甲醛均為分析純.

1.1.3 實驗器材

DHP-781型恒溫培養(yǎng)箱,湖北醫(yī)療器械廠; 722E型分光光度計,上海光譜儀器公司;QL866型漩渦震蕩混合器,江蘇其林貝爾有限公司;SW-CJ-1FD型超凈工作臺,上海新苗有限公司;DK-S28型水浴鍋,上海精宏有限公司.

1.2 膽固醇質量濃度測定方法

膽固醇質量濃度測定方法按文獻進行[5-6],并作適當修改.取0.5 m L培養(yǎng)24 h后的乳酸菌上清液于試管中,加入體積分數(shù)95%乙醇3 mL、0.5mol/L KOH溶液2mL,漩渦震蕩1min后,置于60℃水浴鍋中皂化10min后取出試管迅速冷卻.冷卻完全后加入5 mL正己烷,漩渦震蕩1 min進行萃取,萃取完全后取上層液體于另一干燥潔凈的試管中,靜置10min后加入3 mL水,漩渦振蕩1 min后靜置10 min,待分層后取2.5 mL上層溶液于試管中,置于80℃水浴鍋中加熱揮發(fā)至無液體殘留,取出試管加引用格式:任大勇,翁璐超,劉宏鋒,等.乳酸菌體外降解膽固醇的影響因素研究.食品科學技術學報,2014,32(5):41-45.

REN Dayong,WENG Luchao,LIU Hongfeng,et al.Factors influencing in vitro cholesterol removal ability of lactic acid

bacteria.Journal of Food Science and Technology,2014,32(5):41-45. 4 mL鄰苯二甲醛顯色劑,漩渦振蕩1 min后靜置10 min,加入2 mL硫酸漩渦振蕩1 min,避光靜置10 min后,用分光光度計在波長550 nm處測吸光度,根據(jù)膽固醇與吸光度標準曲線方程計算膽固醇的質量濃度.

1.3 標準曲線繪制

在干燥潔凈的5支試管中分別加入5 mL含膽鹽質量濃度為1.0mg/mL的MRS-THIO培養(yǎng)基,分別再加入0.05,0.10,0.15,0.2,0.25 mL的膽固醇母液使膽固醇質量濃度為20,40,60,80,100mg/L,依照測定膽固醇的方法測定其吸光度,橫坐標為膽固醇質量濃度,縱坐標為吸光度繪制曲線,可得到曲線回歸方程,計算膽固醇的質量濃度.膽固醇的去除率按式(1)計算[7].

膽固醇去除率/%=(1-ρ1/ρ0)×100, (1) 式(1)中,ρ1為培養(yǎng)后菌液中上清液中的膽固醇質量濃度;ρ0為初始培養(yǎng)基中總膽固醇的質量濃度.

1.4 膽鹽質量濃度對乳酸菌降膽固醇能力的研究

分別加入5 mL含有170 mg/L膽固醇(5 mL MRS-THIO培養(yǎng)基加入425μL母液)的MRS-THIO培養(yǎng)基于6支干燥潔凈的試管,添加膽鹽分別至質量濃度為0,2,4,6,8,10mg/mL,接種量按體積比的3%的量接種,接種后將含乳酸菌的培養(yǎng)基于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h,取0.5mL培養(yǎng)后的乳酸菌上清液按膽固醇測定方法測定其剩余的膽固醇質量濃度.以不含乳酸菌的高膽固醇培養(yǎng)基作為空白對照.

1.5 膽固醇質量濃度降膽固醇能力的研究

分別加膽鹽質量濃度為1.0 mg/mL的MRSTHIO培養(yǎng)基5 m L于6支干燥潔凈的試管,再分別加入膽固醇母液75,175,275,375,475,575μL至膽固醇質量濃度為30,70,110,150,190,230mg/L,接種量按體積比的3%的量接種,接種后將含乳酸菌的培養(yǎng)基于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h,取0.5mL培養(yǎng)后的乳酸菌上清液按膽固醇測定方法測定其剩余的膽固醇質量濃度.以不含乳酸菌的高膽固醇培養(yǎng)基作為空白對照.

1.6 培養(yǎng)時間對乳酸菌降膽固醇能力的研究

取7支干燥潔凈的試管,分別加含有170 mg/L膽固醇的膽鹽質量濃度為1.0mg/mL的MRS-THIO培養(yǎng)基5 mL,每種菌按3%的接種量接種,接種后將含乳酸菌的培養(yǎng)基于37℃恒溫箱中分別培養(yǎng)3,7, 11,15,19,23,36 h.取0.5mL培養(yǎng)后的乳酸菌上清液按膽固醇測定方法測定其剩余的膽固醇質量濃度.以不含乳酸菌的高膽固醇培養(yǎng)基作為空白對照.

另取36支試管各加入1 m L膽鹽質量濃度為1.0mg/L的MRS-THIO培養(yǎng)基再分為3組,按3%接種,接種后將含乳酸菌的培養(yǎng)基于37℃恒溫箱中分別培養(yǎng)2,4,6,8,10,12,14,16,18,20,22,24 h,取0.5mL培養(yǎng)后的乳酸菌上清液加入5mL蒸餾水稀釋,再用分光光度計在600 nm波長處測定光密度值,以不含乳酸菌的高膽固醇培養(yǎng)基作為空白對照,繪制生長曲線.

1.7 培養(yǎng)基初始pH值降膽固醇能力的研究

分別加含有170 mg/L膽固醇的膽鹽質量濃度為1.0mg/mL的MRS-THIO培養(yǎng)基5 mL于6支干燥潔凈的試管,分別將pH值調節(jié)為3.0,4.0,5.0, 6.0,7.0,8.0,按3%接種,接種后將含乳酸菌的培養(yǎng)基于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h,取0.5mL培養(yǎng)后的乳酸菌上清液按膽固醇測定方法測定其剩余的膽固醇質量濃度,空白對照為不含乳酸菌的高膽固醇培養(yǎng)基.

2 結果與分析

2.1 標準曲線分析

在牛膽鹽質量濃度為1.0 mg/m L的MRS-THIO培養(yǎng)基中添加質量濃度不同的膽固醇,按照測定膽固醇方法測定吸光度,以吸光度(A550nm)為縱坐標,橫坐標為膽固醇質量濃度(mg/L),繪制標準曲線,見圖1.

圖1 標準曲線Fig.1 Standard curve

2.2 膽鹽質量濃度對乳酸菌降膽固醇能力的影響

膽鹽質量濃度對乳酸菌降膽固醇能力的影響結果見圖2.由圖2可知,膽鹽濃度對6種乳酸菌均有顯著性影響,糞腸球菌、德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌隨著膽鹽質量濃度的增加,對膽固醇的降解能力均先下降后有所增加,在膽鹽質量濃度為4～6mg/mL 時,對膽固醇的去除能力達到最大值,分別為23.1%,33.8%,38.2%.當膽固醇質量濃度再增加時,這四種乳酸菌對膽固醇的降解能力反而有所下降.發(fā)酵乳桿菌和鼠李糖乳桿菌在不加膽鹽時對膽固醇的去除能力最強,去除率分別為32.6%,31.0%,當加入膽鹽時,去除率均顯著降低(P＜0.05).

圖2 膽鹽質量濃度對膽固醇去除率的影響Fig.2 Effect of bile salt concentration on cholesterol removal rate

2.3 膽固醇質量濃度對乳酸菌降膽固醇能力的影響

膽固醇質量濃度對乳酸菌降膽固醇能力的影響結果見圖3.由圖3可知,在膽固醇質量濃度不同的MRS-THIO培養(yǎng)基中,不同質量濃度的膽固醇對6種乳酸菌降解膽固醇的能力均有顯著性影響.隨著膽固醇質量濃度的增加,6種乳酸菌降解膽固醇的能力均有所提高,當膽固醇質量濃度達到230mg/L時,發(fā)酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌、糞場球菌、德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌去除膽固醇的能力均達到最大值,分別為33.5%,27.6%,27.4%,25.7%,39.0%.鼠李糖乳桿菌在膽固醇質量濃度為190mg/L時,對膽固醇的去除率最大,為30.9%,在膽固醇質量濃度為230mg/L時,鼠李糖乳桿菌對膽固醇的降解反而有所下降,去除率為27.7%.

圖3 膽固醇質量濃度對膽固醇去除率的影響Fig.3 Effect of cholesterol concentration on cholesterol removal rate

2.4 培養(yǎng)基初始pH值對乳酸菌降膽固醇能力的影響

培養(yǎng)基初始pH值對乳酸菌降膽固醇能力的影響結果見圖4.由圖4可知,pH值對6種乳酸菌降解膽固醇都有顯著的影響.發(fā)酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌均在酸性環(huán)境中對膽固醇的去除能力較強.發(fā)酵乳桿菌在pH值3.0 時,對膽固醇的降解能力最強,去除率達到53.8%;其次是嗜酸乳桿菌,在pH值3.0時,對膽固醇的去除率為46.5%.隨著pH值＞4.0時,這4種乳酸菌對膽固醇的降解能力均顯著下降(P＜0.05).而糞腸球菌隨pH值的增加,對膽固醇的降解能力先增加后下降,在pH值6.0時,對膽固醇的去除率達到最大值30.0%.鼠李糖乳桿菌在中性環(huán)境中對膽固醇的降解能力最強,在pH值7.0時,對膽固醇的去除率為26.1%.

圖4 培養(yǎng)基初始pH值對膽固醇去除率的影響Fig.4 Effect ofmedium initial pH on cholesterol removal rate

2.5 培養(yǎng)時間對乳酸菌降膽固醇能力的影響

6種受試乳酸菌的生長曲線見圖5,乳酸菌發(fā)酵時間對其降膽固醇能力的影響結果見圖6.由圖6可知,菌株的生長時間對膽固醇的降解能力有顯著影響.發(fā)酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌在培養(yǎng)3 h時膽固醇的去除率分別為37.0%,36.1%, 29.9%,隨著菌株生長時間的增加,這3種菌對膽固醇的去除能力均有所增加,在培養(yǎng)11～15 h時最早達到最佳去除率,此時膽固醇的去除率分別為43.0%,43.6%,41.7%.糞腸球菌、德氏乳桿菌、鼠李糖乳桿菌在培養(yǎng)3 h時膽固醇的去除率分別為31.0%,32.1%,30.2%,在培養(yǎng)19 h后對膽固醇的去除能力迅速增加,培養(yǎng)23 h后去除能力迅速增加,此時膽固醇的去除率分別達到最高值為39.4%,43.0%,43.3%.

圖5 6種乳酸菌在MRS-THIO培養(yǎng)基中的生長情況Fig.5 Growth curves of six kinds of lactic acid bacteria in the MRS-THIO medium

圖6 培養(yǎng)時間對膽固醇去除率的影響Fig.6 Effect of incubation time on cholesterol removal rate

3 討論與結論

有研究表明,適量濃度的膽鹽可以使菌體細胞壁通透性增加,膽固醇被吸收至細胞內部,而濃度過高的膽鹽會抑制細菌生長,因而不利于菌體細胞吸收膽固醇[8-10].本研究使用的測試的6種乳酸菌中保加利亞乳桿菌、糞腸球菌、德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌與之前的研究一致.

本研究中,在低膽固醇濃度下6種乳酸菌對膽固醇降解能力較差,隨著膽固醇濃度的增加,乳酸菌對膽固醇的降解能力隨之提高,如在膽固醇質量濃度為30～70 mg/L時只有鼠李糖乳桿菌對膽固醇的去除率為2.3%,其他5種菌株對膽固醇的去除率菌均為0;在膽固醇質量濃度大于110 mg/L時,乳酸菌對膽固醇的降解能力明顯提高,原因并不明確,可能是因為不同菌株對膽固醇降解的機理不同[11].

pH值對乳酸菌降解膽固醇的能力有顯著影響.本實驗中,發(fā)酵乳桿菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌均在酸性環(huán)境中對膽固醇的去除能力較強.而糞腸球菌在弱酸性環(huán)境中對膽固醇的降解能力較強,鼠李糖乳桿菌在中性環(huán)境中對膽固醇的降解能力最強.雖然目前對于乳酸菌降解膽固醇的機理尚無定論,但人們更多傾向于活體乳酸菌通過吸收和共沉淀聯(lián)合作用以降低膽固醇的觀點[12-13].Klaver 等[14]研究表明酸性環(huán)境對膽酸和膽固醇發(fā)生共沉淀現(xiàn)象有利,因此有利于膽固醇的降解.

此外,本研究還表明,菌株的培養(yǎng)時間對其降解膽固醇的能力具有顯著影響,隨著菌株生長時間的增加這菌株對膽固醇的去除能力隨著增加.除了糞腸球菌、德氏乳桿菌、鼠李糖乳酸菌在培養(yǎng)23 h后對膽固醇的去除率達到最大值外,其余的3種菌株在培養(yǎng)11 h后對膽固醇的去除率就已達到最大值,這可能與不同菌種所需要活化的時間不同有關.

本實驗結果表明,受試6種乳酸菌對膽固醇均有一定的降解能力,乳酸菌對膽固醇的降解能力因膽鹽濃度、膽固醇濃度、pH值、培養(yǎng)時間和菌株種類的不同而表現(xiàn)出較大的差異.其中發(fā)酵乳桿菌在膽鹽質量濃度為1.0 mg/mL、膽固醇質量濃度為170 mg/L、pH值3.0的MRS培養(yǎng)基對膽固醇的降解能力最強,達到 53.8%;嗜酸乳桿菌次之,達到46.5%.

[1] 劉長建,姜波,安曉雯,等.菠菜中降膽固醇乳酸菌的篩選及鑒定[J].食品與生物技術學報,2010,29(6): 937-940.

[2] Grunewald K K.Sera cholesterol levels in rats fed skim milk fermented byLactobacillus acidophilus[J].J Food Sci,1982,47(2):2078-2079.

[3] Lin SY,Ayres JW,WilliaW JR,et al.Lactobacilluseffects on cholesterol:In vitroandin vivoresults[J].J Dairy Sci,1989,72(2):2882-2889.

[4] 肖琳琳,董明盛.西藏干酪乳酸菌降膽固醇特性研究[J].食品科學,2003,24(10):142-145.

[5] Gilliland S E,Nelson C R,Maxwell C.Assimilation of cholesterol byLactobacillusacidophilus[J].Appl Environ Microb,1985,49(2):377-381.

[6] 李常營,盧曉霆,于志會,等.酸菜來源植物乳桿菌S4-5的降膽固醇作用[J].食品科學,2011,32(7):69 -72.

[7] 田建軍,張開屏,靳燁.高效降膽固醇乳酸菌的篩選[J].食品科技,2011,36(11):21-30.

[8] Noh D O,Kim SH,Gilliland SE.Incorporation of cholesterol into the cellmembrance ofLactobacillusacidophilusATCC43121[J].JDairy Sci,1997,80:3107-3113.

[9] 靳志強,王延祥,李平蘭,等.植物乳桿菌耐酸耐膽鹽的體外試驗及其降膽固醇作用[J].中國食品學報, 2009(5):24-28.

[10] 焦月華,張?zhí)m威,易華西,等.酸牦牛乳中乳酸菌降膽固醇作用及膽鹽耐受性研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2012,43(2):6-12.

[11] 王一鳴,范小兵,杭曉敏,等.體外去除膽固醇菌株的篩選及其作用機理研究[J].微生物學報,2006,33 (6):43-47.

[12] Tahri K,Crociani J,Ballongue J,etal.Effects of three strains of bifidobacteria on cholesterol[J].Lett Appl Microbiol,1995,21(3):149-151.

[13] Tahri K,Grill J P,Schneider F.Bifidobacteria strain behavior toward cholesterol:coprecipitation with bile salts and assimilation[J].Curr Microbiol,1996,33 (3):187-193.

[14] Klaver FA K,Van Der Meer R.The assumed assimilation of cholesterol by Lactobacilli and Bifidobacterium bifidum is due to their bile salt deconjugation activity [J].Appl Environ Microb,1993,59(4):1120-1124.

Factors Influencing in vitro Cholesterol Removal Ability of Lactic Acid Bacteria

REN Dayong1, WENG Luchao1, LIU Hongfeng2, ZHOU Tingting1, ZHANG Zhenye1, SHAO Lifang1
(1.College ofFood Science and Engineering,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;
2.College of Veterinary Medicine,Jilin University,Changchun 130062,China)

The aim of the present study was to evaluate the in vitro cholesterol removal ability of different lactic acid bacterial strains.Single factor experimentswere carried out to explore the influences of oxgall addition,cholesterol addition,medium pH,and incubation time on the cholesterol removal ability of the strains.The results showed that cholesterol removal rate was significantly affected by the above factors. Under the same conditions,considerable variation was found among lactic acid bacterial strainswith regard to the ability to assimilate cholesterol from a laboratory growthmedium.Generally,the highest cholesterol removal rate(more than 50%)was obtained under the condition of the oxgal concentration 4-6mg/mL, cholesterol concentration 190-230mg/L,medium initial pH 5-7,and incubation time 11-23 h.

lactic acid bacteria;cholesterol;influence factor;in vitro

李 寧)

TS201.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2014.05.008

2095-6002(2014)05-0041-05

2013-09-30

吉林省科技發(fā)展計劃項目(20130522175JH);吉林農(nóng)業(yè)大學大學生科技創(chuàng)新基金(2012).

任大勇,男,副教授,博士,主要從事食品微生物方面的研究.