劉云，盧婷，張力國，趙明禮，孫冬冬，孫思超，梁偉峰，周國輝，師東方，于力

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150001）

牛源性Escherichia coli O157∶H7分離鑒定、耐藥性及耐藥基因分析

劉云1，盧婷1，張力國1，趙明禮1，孫冬冬1，孫思超1，梁偉峰1，周國輝2，師東方1，于力2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，哈爾濱 150030；2.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150001）

了解某牛場犢牛群發(fā)腹瀉后繼發(fā)胸膜炎、腹膜炎并造成犢牛大量死亡的主要病原菌及其耐藥性情況。采集病死犢牛肺、腹膜和腸系膜等臟器，進行病原菌分離、鑒定，并對分離的主要致病菌株進行藥敏試驗及耐藥基因檢測。結(jié)果表明，引起此次犢牛腹瀉及胸膜炎、腹膜炎的主要致病菌為E.coli O157:H7；藥敏試驗結(jié)果表明分離菌對青霉素、四環(huán)素和氨芐西林等12種抗生素耐藥，對頭孢哌酮、頭孢他啶、丁胺卡那等8種抗生素敏感，表現(xiàn)為多重耐藥。該分離菌同時攜帶tetB、strB、aadB、aphA、floR和TEM等耐藥基因，耐藥基因型和耐藥表型不完全相同。研究可為E.coli O157:H7的防治和耐藥性控制提供依據(jù)。

E.coli O157:H7；藥敏試驗；耐藥基因

腸出血性大腸桿菌（EHEC）血清型主要包括E.coliO157∶H7,O157∶NM,O26∶H8,O125∶NM和O45∶H2等，其中以O(shè)157∶H7血清型為主，約占90%以上，是引起出血性腸炎主要病原體[1]。1982年，E.coliO157∶H7第一次在被污染的漢堡中分離得到，牛和其他反芻動物（羊和鹿等）已成為自然宿主，其中牛是主要宿主[2]。Sanchez等研究表明，豬也是E.coliO157∶H7的宿主[3]。E.coliO157: H7分泌的志賀菌素能夠引起人類疾病，如出血性腸炎（Haemorrhagic colitis,HC）、溶血性尿毒綜合癥（Haemolytic curaemic syndrome,HUS）和血栓性血小板減少性紫癜（Thrombotic thrombocytopenic pur?pura,TTP）等。世界衛(wèi)生組織已將E.coliO157:H7列為新的食源性病原菌，E.coliO157:H7感染已成為全球性的公共衛(wèi)生問題[4]。

動物大腸桿菌疾病，如仔豬黃白痢、豬的水腫病、犢牛痢疾及禽類大腸桿菌引起的敗血癥、腹膜炎、輸卵管炎、滑膜炎等，因大腸桿菌種類繁多，又有不同的血清型，同一血清型有不同亞型，其毒力和致病力不一。E.coliO157:H7是引起人出血性和致死性胃腸炎的主要病原之一，但動物關(guān)于E.coliO157:H7引發(fā)的疾病研究不多。2011年10月，黑龍江省某牛場犢牛出生后出現(xiàn)嚴重水樣腹瀉，發(fā)病率100%，發(fā)病后犢牛陸續(xù)死亡。剖檢其主要病理變化為心、肝、脾、肺、腎、腸管和腹膜等處均有不同程度出血，出血性胸膜炎、腹膜炎癥狀明顯，臨床疑似為大腸桿菌感染。為了解引起該牛場牛發(fā)病的病源特性，本試驗采集病死牛的病料，肺臟、腸系膜、胸膜及腹膜，進行病原菌分離、鑒定，對其進行藥敏試驗及耐藥基因檢測，為進一步研究其生物學特性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌臨床分離株：分離自黑龍江省某牛場病死犢牛肺、腹膜和腸系膜等臟器。采集病料放入冰盒內(nèi)，12 h內(nèi)帶回東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院外科實驗室。大腸桿菌質(zhì)控菌株ATCC 25922和標準菌株E.coliCICC 21530購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂、腦心浸液肉湯（BHI）等培養(yǎng)基及腸桿菌科生化鑒定管等購自杭州天和微生物試劑有限公司；TaKaRa ExTaq（5 U·μL-1）、DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司；所有PCR引物均由上海英俊試劑公司合成。

1.1.3 試驗藥物

頭孢哌酮（CFP）、頭孢曲松（CRO）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢他啶（CAZ）、氨芐西林（AM）、青霉素（P）、丁胺卡那（AN）、紅霉素（E）、卡比西林（CB）、呋喃妥因（FT）、四環(huán)素（TC）、鏈霉素（S）、慶大霉素（GM）、卡那霉素（K）、氯霉素（C）、利福平（RA）、妥布霉素（TC）、環(huán)丙沙星（CIP）、克林霉素（CLI）和復方新諾明（SXT）等20種藥敏紙片均購自康泰生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1E.coli菌株的分離與生化試驗

將采集的樣品接種于麥康凱培養(yǎng)基，于37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，挑取單個光滑、粉紅色菌落接種于伊紅美藍培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，挑取具有金屬光澤的菌落進行革蘭氏染色、鏡檢，并接種于BHI液體培養(yǎng)基進行增菌。選擇生化微量管葡萄糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、棉子糖、蕈糖、果糖、山梨醇、硝酸鹽、VP、衛(wèi)矛醇、蔗糖、H2S、靛基質(zhì)和枸櫞酸鹽進行常規(guī)生化檢測，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.2.2E.coli菌株的DNA擴增

分離出的E.coli菌株接種在5 mL BHI液體培養(yǎng)基中，37℃震蕩12～18 h。吸取1.5 mL BHI培養(yǎng)基，以10 000 r·min-1離心2 min。菌泥加入100 μL無菌蒸餾水孵育10 min，放置在冰盒上冷卻5 min，混合物以10 000 r·min-1離心2 min。移除懸液并于-20℃儲存，作為DNA模板用于之后的PCR分析[5]。

1.2.3 分離菌株的鑒定

分離菌株用16S rRNA通用引物[6]進行PCR擴增，擴增反應(yīng)體系（25 μL）：10×buffer 2.5 μL，4 μL dNTPs，0.5 UTaqDNA酶，2 mmol·L-1MgCl2，每個引物1 μL，模板DNA 2 μL，用滅菌蒸餾水補到25 μL，標準菌株E.coliATCC 25922作為陽性對照。擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳（1×TAE，EB染色，20 min，20 V），凝膠影像用凝膠成像儀進行照相，利用膠回收試劑盒回收產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果經(jīng)Blast比對。

利用編碼E.coli菌體抗原O157的基因rfbEO157和編碼E.coli結(jié)構(gòu)性鞭毛抗原H7的基因fliCH7檢測分離菌株的血清型[7]，擴增反應(yīng)體系（25 μL）：模板DNA 2 μL，每個引物1 μL，dNTPs 4 μL，10× Buffer 2.5 μL，Tap酶0.5 μL，用滅菌蒸餾水補足25 μL，標準菌株E.coliCICC 21530作為陽性對照。

1.2.4E.coliO157：H7菌株的藥敏試驗

使用Mueller-Hinton瓊脂通過紙片擴散法（K-B法）實施。將細菌接種于BHI培養(yǎng)基中，置于37℃搖床培養(yǎng)10 h，用生理鹽水校正至與0.5麥氏單位標準比濁管相同，在15 min內(nèi)，用無菌棉簽拭子蘸取菌液均勻涂布于Mueller-Hinton瓊脂平板整個表面。對頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、氨芐西林、青霉素、丁胺卡那、紅霉素、卡比西林、呋喃妥因、四環(huán)素、克林霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、氯霉素、利福平、妥布霉素、環(huán)丙沙星和復方新諾明共20種藥物進行藥敏試驗。

在需氧環(huán)境下37℃培養(yǎng)18～24 h，使用E.coliATCC 25922作為質(zhì)控菌株，通過游標卡尺測量抑菌環(huán)直徑，并根據(jù)NCCLS標準判斷分離株對受試抗菌藥物的敏感性[8]。

1.2.5 分離菌株的耐藥基因檢測

根據(jù)大腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、鏈霉素類、磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類抗生素的耐藥機制，選取SHV、floR、aacA4等14種耐藥基因用于分析E.coliO157：H7攜帶的耐藥基因型。

利用提取的分離菌株DNA模板分別對14種耐藥基因進行PCR檢測。擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳（1×TAE，EB染色，20 min，120 V），凝膠影像用凝膠成像儀進行照相，反應(yīng)引物及退火溫度見表1。

表1 本研究中所使用的引物Table 1 Primers used in the study

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離與生化試驗結(jié)果

通過麥康凱與伊紅美藍培養(yǎng)基的篩選，分離菌株在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈圓形，稍隆起的粉紅色菌落光滑濕潤，邊緣整齊。在伊紅美藍平板上呈現(xiàn)出帶有金屬光澤的紫黑色菌落。革蘭氏染色為陰性（見圖1）。經(jīng)微量生化管進行檢測（見表2），參照《伯杰細菌鑒定手冊》[10]，分離菌株符合E. coli菌株的典型生化特征。

圖1 分離菌株鏡檢形態(tài)Fig.1 Morphology of isolates in the microscope

表2 分離菌株的生化試驗結(jié)果Table 2 Biochemical experimental results of the isolate

2.2 分離菌株的PCR鑒定

分離菌株經(jīng)16S rRNA通用引物進行擴增，產(chǎn)物測序結(jié)果與GenBank中已知E.coli16S rRNA序列同源性達99%，鑒定結(jié)果表明該分離菌株為E.coli。通過檢測rfbEO157基因與fliCH7基因，證明分離菌株的血清型為O157∶H7（見圖2）。

2.3 藥敏試驗結(jié)果

E.coliO157∶H7分離株對抗生素敏感性檢測結(jié)果見表3。結(jié)果可知，分離菌株對頭孢他啶、頭孢哌酮、慶大霉素、卡那霉素、丁胺卡那、妥布霉素、氯霉素和呋喃妥因共8種抗生素敏感，對青霉素、氨芐西林、卡比西林、頭孢噻肟、頭孢曲松、環(huán)丙沙星、鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素、復方新諾明、克林霉素和利福平12種抗生素表現(xiàn)為耐藥。

圖2 分離菌株E.coli O157:H7 rfbEO157基因與fliCH7基因的擴增結(jié)果Fig.2 rfbEO157 gene and fliCH7 gene amplificated in E.coli O157:H7 isolate

2.4 分離菌株耐藥基因的PCR檢測結(jié)果

以分離菌株的DNA為模板進行PCR擴增，擴增出tetB、strB、aadB、aphA、floR和TEM耐藥基因的特異性條帶，未檢測出qnrs，sul3，CMY-2,cl?mA、strA、aacA4、sul2和tetA耐藥基因。PCR擴增凝膠電泳結(jié)果見圖3。

圖3 分離菌株E.coli O157:H7耐藥基因的擴增結(jié)果Fig.3 Resistance genes detected in E.coli O157:H7 isolate

3 討論

本研究從患有腹瀉和胸膜炎犢牛的病料中分離出病原菌，經(jīng)麥康凱培養(yǎng)基和伊紅美蘭培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)后，再進行革蘭氏染色，生化試驗和多重PCR方法分離鑒定出一株E.coliO157：H7，為致病性大腸桿菌。Jame等對奶制品和牛肉的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，動物中血清型O157:H7的檢出率在0～2.8%，而最高的檢出率來源于犢牛而非成年牛[11]。與本研究從患有腹瀉和胸腹膜炎的犢牛中分離出O157∶H7結(jié)果一致。目前，EHEC O157∶H7檢測有血清學檢測、免疫學檢測、分子生物學檢查等方法，本研究采用王革華多重PCR方法鑒定分離菌株的血清型，利用標準質(zhì)控菌株CICC 21530作為陽性對照，檢測編碼E.coli菌體抗原O157的基因rfbEO157和編碼E.coli結(jié)構(gòu)性鞭毛抗原H7的基因fliCH7。此方法能夠快速檢測出血清型O157∶H7，操作簡單、檢測周期短、價格低廉且敏感性高，適合EHEC O157:H7實驗室診斷分析。

大腸桿菌普遍存在于環(huán)境中和動物機體內(nèi)，在獸醫(yī)臨床抗生素選擇壓力下耐藥菌株增多。由于耐藥基因可以在細菌間水平傳播，新耐藥表型不斷產(chǎn)生，很多細菌已由單一耐藥發(fā)展到多重耐藥，不僅給預(yù)防和治療動物疾病帶來困難，而且加劇抗生素在畜禽體內(nèi)的殘留，嚴重危害動物性食品安全。本研究表明該牛場致犢牛爆發(fā)胸膜炎、腹膜炎的E.coliO157:H7菌株多重耐藥，對第一、二代頭孢類抗生素嚴重耐藥，對頭孢哌酮、頭孢他啶敏感；對氨基糖苷類抗生素普遍敏感，僅對鏈霉素耐藥，對四環(huán)素、利福平、復方新諾明、環(huán)丙沙星和紅霉素有較強耐藥性，并對其他抗生素也有不同程度的耐藥。本研究結(jié)果與劉明春等[12]、李軍等[13]、趙秋華等[14]、張秀英等[15]報道基本一致。

大腸桿菌耐藥性的產(chǎn)生主要與兩個因素有關(guān)：耐藥基因的存在和藥物的選擇性壓力。質(zhì)粒介導的抗生素耐藥基因不僅可垂直傳給子代，更重要的是可在不同微生物間進行水平傳播。根據(jù)Mathur等的報道[16-19]，本研究分別針對β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、鏈霉素類、磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類設(shè)計14對引物。耐藥基因PCR擴增結(jié)果顯示，該分離菌株攜帶tetB、strB、aadB、aphA、floR和TEM耐藥基因。故該分離菌株的耐藥基因型為四環(huán)素類，鏈霉素類，氨基糖苷類，氯霉素類和β-內(nèi)酰胺類。

本研究發(fā)現(xiàn)，該菌株耐藥表型和耐藥基因型不完全匹配，分離菌攜帶氯霉素和氨基糖苷類的耐藥基因，但并不表現(xiàn)出這兩類的耐藥表型。這可能是由于不同耐藥基因表達的酶不同，各種酶的耐藥譜不同，因此耐藥表型和耐藥基因型間存在差異。建議在今后E.coliO157:H7治療過程中慎重用藥，避免新耐藥性產(chǎn)生，防止細菌間耐藥基因水平傳播。

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Isolation and identification ofEscherichia coliO157∶H7 from cattle and analysis of resistant gene

LIU Yun1,LU Ting1,ZHANG Liguo1,ZHAO Mingli1,SUN Dongdong1,SUN Sichao1,LIANG Weifeng1,ZHOU Guohui2,SHI Dongfang1,YU Li2
(1.School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Harbin Veterinary Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150001,China)

To investigate pathogenic bacteria which caused serious calf diarrhea,theEscherichia coliO157∶H7 isolate was isolated from diseased tissue and identified by PCR method.The result of drug sensitivity test showed that the strain exhibited certain degrees of drug resistance to 12 kinds of antibiotics resistance,such as penicillin,tetracycline and ampicillin.While the strain was susceptible to eight kinds of antibiotics resistanc,such as cefoperazone,ceftazidime,amikacin.The strain possessedtetB,strB,aadB,aphA,floRandTEMgenes.The drug resistant genotype and the resistance phenotype was not identical.

E.coliO157∶H7;drug sensitivity test;resistance genes

S858.23

A

1005-9369（2014）11-0083-06

2014-03-25

獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室開放課題基金項目（SKLVBF201303）；國家科技部支撐項目（2012BAD12B03，2012BAD12B05）

劉云（1964-），女，教授，博士，博士生導師，研究方向為腫瘤分子生物學及奶牛疾病等。E-mail:abliuyun@yeah.net

時間2014-11-21 16:39:00[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20141121.1639.008.html

劉云,盧婷,張力國,等.牛源性E.coliO157∶H7分離鑒定、耐藥性及耐藥基因分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2014,45(11):83-88.

Liu Yun,Lu Ting,Zhang Liguo,et al.Isolation and identification ofEscherichia coliO157∶H7 from cattle and analysis of resistant gene[J].Journal of Northeast Agricultural University,2014,45(11):83-88.(in Chinese with English abstract)